直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化

1、www.CRTER.org李興福，等. 直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化李興福1，段 莉2，梁宇杰3，朱偉民2，王大平2(1廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東省廣州市 510182；2深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市第二人民醫(yī)院，廣東省深圳市 518035；3北京大學(xué)深圳研究生院，廣東省深圳市 518035)引用本文：李興福，段莉，梁宇杰，朱偉民，王大平. 直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化J.中國(guó)組織工程研究，2017，21(1):18-24.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.004 OR

2、CID: 0000-0001-5044-8098(李興福)文章快速閱讀：直接共培養(yǎng)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化的影響實(shí)驗(yàn)分組：(1)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照；(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照；(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性對(duì)照；(4)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(11)；(5)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(31)；(6)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(51)。檢測(cè)指標(biāo)：(1)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)型膠原(COL2A1)的表達(dá)水平； (2)Western blot檢測(cè)細(xì)胞SOX9型膠原、型膠原蛋白表達(dá)水平；(3)實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)SOX9

3、、Col1a1、Col2a1 mRNA表達(dá)。李興福，男，1988年生，山東省鄒城市人，漢族，廣州醫(yī)科大學(xué)在讀碩士，醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨組織工程的研究。通訊作者：王大平，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市第二人民醫(yī)院，廣東省深圳市 518035 中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2017)01-00018-07稿件接受：2016-10-17結(jié)果說明：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)可明顯促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并有效抑制細(xì)胞纖維化。文題釋義：共培養(yǎng)：20世紀(jì)80年代后期，為了建立更類似于體內(nèi)環(huán)

4、境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長(zhǎng)增殖，人們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞。其在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。有報(bào)道從人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，免疫原性比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低，并且具有取材方便，無倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)

5、點(diǎn)，因此越來越受到研究工作者們的關(guān)注。摘要背景：軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都可用于構(gòu)建組織工程化軟骨，但體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞容易發(fā)生去分化，表型難以維持，以致其臨床應(yīng)用受到限制。目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化的影響，以及直接共培養(yǎng)的最佳比例。方法：分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)分為6組：直接共培養(yǎng)組按照人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比例為 11，31及51(人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)；陽性對(duì)照組用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1細(xì)胞因子誘導(dǎo)；人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組。免疫熒光細(xì)胞

6、化學(xué)檢測(cè)型膠原(COL2A1)的表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)細(xì)胞SOX9型膠原、型膠原蛋白表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)SOX9、Col1a1、Col2a1 mRNA表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論：成功分離并鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)28 d后，共培養(yǎng)組及單獨(dú)藥物誘導(dǎo)的陽性對(duì)照組型膠原免疫熒光檢測(cè)均呈陽性；陽性對(duì)照組的Col2a1 mRNA表達(dá)水平高于共培養(yǎng)組，但型膠原蛋白表達(dá)總量低于共培養(yǎng)組，11共培養(yǎng)組的Col2a1 mRNA表達(dá)水平高于31和51共培養(yǎng)組。陽性對(duì)照組和共培養(yǎng)組的Col1a1 mRNA表達(dá)水平和型膠原蛋白表達(dá)水平均低于人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白

7、對(duì)照組。結(jié)果說明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)可明顯促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并有效抑制細(xì)胞纖維化，從縮減軟骨細(xì)胞用量方面看，直接共培養(yǎng)體系的適宜比例為51。采用直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的成本較低，是一種較為經(jīng)濟(jì)合理的誘導(dǎo)方法。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；臍帶臍血干細(xì)胞；共培養(yǎng)；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；軟骨細(xì)胞分化；國(guó)家自然科學(xué)基金主題詞：干細(xì)胞；臍帶；間質(zhì)干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083基金資助：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81572198，81260161，8100

8、0460)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030313772)；深圳市科技創(chuàng)新委技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(JSGG2014051905550503)；深圳市科技創(chuàng)新委國(guó)際科技合作項(xiàng)目(GJHZ20130412159306739)；深圳市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提升項(xiàng)目(CXB201104220049A)；深圳市科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20140414470821200，JCYJ20140414170821160)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2013 M530385)Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into chon

9、drocytes induced by direct co-culture with chondrocytes Li Xing-fu1, Duan Li2, Liang Yu-jie3, Zhu Wei-min2, Wang Da-ping2 (1Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Second Peoples Hospital, Shenzhen 518035, Gu

10、angdong Province, China; 3Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Both chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) can be used to construct tissue-engineered cartilage. Chondrocytes cultured in vitro however are prone to dediffere

11、ntiation and difficult to maintain phenotypes, and accordingly, their clinical application is limited.OBJECTIVE: To explore the effect of human articular chondrocytes and human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) co-culture in vitro on the chondrogenic differentiation of hUC-MSCs and to

12、 optimize the co-culture ratio.METHODS: The hUC-MSCs surface marker was identified by flow cytometry. Human articular chondrocytes and hUC-MSCs were co-cultured at the ratio of 1:1, 3:1 and 5:1. The hUC-MSCs induced by transforming growth factor-beta 1 were set as a positive control group. Human art

13、icular chondrocytes and hUC-MSCs cultured alone were set as two negative control groups. The expression level of type II collagen (COL2) was analyzed by immunofluorescence staining. The protein expression of SRY-box9 (SOX9), type I collagen (COL1) and COL2 were determined by western blot. The mRNA l

14、evels of SOX9, Col1a1 and Col2a1 were detected by quantitative real-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION: The hUC-MSCs were isolated from the human umbilical cord and identified with flow cytometry. After 28 days of culture, both the co-culture group and the positive control group were observed with pos

15、itive staining under the immunofluorescence microscope. The Col2a1 mRNA expression level of the positive control group was higher than that of the co-culture group, but the total COL2 protein expression was lower. The Col2a1 mRNA expression level of the co-culture group in 1:1 was higher than that o

16、f the co-culture group in 3:1 or 5:1. Col1a1 mRNA and COL1 protein expression levels of the positive control group and co-culture group were lower than those of human articular chondrocyte negative control group. To conclude, the co-culture of hUC-MSCs and human articular chondrocytes significantly

17、induces the hUC-MSC differentiation into chondrocytes and effectively restrains cell fibrosis. The optimal cell ratio in the co-culture system is demonstrated to be 5:1 (hUC-MSCs:chondrocytes). Therefore, the direct co-culture can be an economic way for inducing hUC-MSC differentiation into chondroc

18、ytes, which provides reliable seeding cells for cartilage tissue engineering. Subject headings: Stem Cells; Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Chondrocytes; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81572198, 81260161, 81000460; the Natural Science Foundat

19、ion of Guangdong Province, No. 2015A030313772; the Tackle Key Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Commission, No. JSGG2014051905550503; the International Scientific Cooperation Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Commission, No. GJHZ20130412159306739; the Promotio

20、n Project of Shenzhen Key Laboratories, No. CXB201104220049A; Shenzhen Science and Technology Research Project, No. JCYJ20140414470821200, JCYJ20140414170821160; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2013M530385Cite this article: Li XF, Duan L, Liang YJ, Zhu WM, Wang DP. Differentiation of huma

21、n umbilical cord mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by direct co-culture with chondrocytes. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(1):18-24.Li Xing-fu, Studying for masters degree, Physician, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, ChinaCorresponding autho

22、r: Wang Da-ping, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Second Peoples Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China21ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction關(guān)節(jié)軟骨主要由透明軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(以型膠原和多聚蛋白多糖為主)構(gòu)成，無血管和神經(jīng)支配

23、，損傷后難以自我修復(fù)1，易發(fā)生嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)病。 目前，軟骨組織工程技術(shù)在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方面已得到廣泛應(yīng)用2。軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都可用于構(gòu)建組織工程化軟骨，但體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞容易發(fā)生去分化，表型難以維持，以致其臨床應(yīng)用受到限制3。與軟骨細(xì)胞相比，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSCs)來源充足，并具有多向分化潛能和低免疫原性，作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)4-6。為解決軟骨組織工程種子細(xì)胞的供給問題，人們努力探究高效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的方法。傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法，如藥物誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，誘導(dǎo)

24、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的效率低且成本高，難以在臨床推廣。與傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法相比，共培養(yǎng)誘導(dǎo)效率高且成本低，并能有效抑制人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞肥大化，具有更好的臨床應(yīng)用前景7-11。實(shí)驗(yàn)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)，探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)的最佳比例和獲取軟骨組織工程種子細(xì)胞的最佳方法。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年5至9月在深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 材料 型膠原蛋白酶、胰蛋白酶、地塞米松，胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑(IT

25、S)、維生素C (Sigma-Aldrich公司)，MesenGro培養(yǎng)液(StemRD公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(PeproTech公司)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式檢測(cè)抗體購置于Bioscience公司，胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)，實(shí)時(shí)熒光定量上游引物(上海生工)。其余生化試劑無特別說明均購自美國(guó)Sigma公司。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 實(shí)驗(yàn)用新生兒臍帶(n=7)，取自深圳市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)

26、科，產(chǎn)婦體健，足月剖宮產(chǎn)，產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)。無菌條件下，取臍帶5-8 cm，剔除血管和外膜后，余下的膠凍狀組織，即沃頓膠(Wharton，sjelly，WJ)剪碎至1.0-2.0 mm3大小，按一定比例均勻放置于含MesenGro培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞游出后，用胰蛋白酶消化離心，置于T25培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，消化離心后加入新培養(yǎng)基置37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗原(CD105-PE、CD73-AP

27、C、CD34-PE、CD45-FITC)4。 1.4.2 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng) 人關(guān)節(jié)軟骨由深圳市第二人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科提供，自愿者及其家屬均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)。無菌條件下，取外傷患者截肢關(guān)節(jié)軟骨，型膠原酶消化后過濾，離心，棄上清，收集軟骨細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞達(dá)到80%-90%匯合時(shí)，消化、傳代成第1代細(xì)胞，置37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培 養(yǎng)12。1.4.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)增殖期的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和第2代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，接種于放有DMEM/F12培養(yǎng)液的六孔板直接共培養(yǎng)體系中，按表1所示比例共培養(yǎng)。

28、以分別單獨(dú)培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為空白對(duì)照，以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1細(xì)胞因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞為陽性對(duì)照。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%匯合時(shí)，陽性對(duì)照組加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組仍用DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。表1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)比例 Table 1 The co-culture ratio of human umbilical cord mesenchymal stem cells to human articular chondrocytes組別人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(cells/cm2)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(cells/c

29、m2)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照-0.6104人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照0.6104-人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性對(duì)照0.6104-人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(11)0.31040.3104人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(31)0.451040.15104人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)(51)0.51040.11041.4.4 型膠原的免疫熒光檢測(cè) 共培養(yǎng)28 d后，細(xì)胞用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗3次，0.2%Triton X100透膜處理，再用PBS洗3次，5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫濕盒封閉30 min。PB

30、S洗3次，型膠原一抗(1100)4 孵育過夜。PBS洗3次，兔抗鼠的FITC標(biāo)記的二抗(1：200)室溫避光孵育60 min。PBS洗3次，DAPI室溫避光孵育10 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照13。1.4.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SOX9、COL1A1和COL2A1 mRNA表達(dá) 取第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、共培養(yǎng)前后及誘導(dǎo)分化后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用Trizol試劑盒按說明書提取細(xì)胞總RNA。微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop)測(cè)RNA純度及含量，各RNA樣本(A260/A280)均在1.7-2.1。取2.5 g RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real

31、-time PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。取上述反轉(zhuǎn)后cDNA產(chǎn)物1 L做模板，以GAPDH作為內(nèi)參照，利用SYBR Green 染料實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SOX-9、型膠原、型膠原基因在不同處理組中的相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 預(yù)變性30 s；95 5 s， 60 30 s，40個(gè)循環(huán)；90 15 s；60 1 min。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，用GADPH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用Ct方法12，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，所使用引物序列見表214。表2 SOX9、Col1a1和Col2a1的實(shí)時(shí)定量PCR引物序列 Table 2 PCR primers and sequence

32、s for SOX9, Col1a1 and Col2a1GenesForward primer (5-3)Reverse primer (5-3)SOX-9GTA CCC GCA CTT GCA CAA CTCG CTC TCG TTC AGA AGTCTCCol2a1GTC ACC CAC CGA CCA AGA AAC CAAG TCC AGG CTG TCC AGGGAT GCol1a1CCA ACA AGC ATG TCT GGT TAG GAGGCA ATG CTG TTC TTG CAG TGG TAGAPDHGAT CAT CAG CAA TGC CTC CTTGT GGT C

33、AT GAG TCC TTC CA1.4.6 Western-blot檢測(cè)SOX9、型膠原和型膠原蛋白表達(dá)水平 共培養(yǎng)28 d后，用RIPA lysis buffer提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。分別以SOX9、COL1A1和COL2A1 一抗及帶HRP的二抗進(jìn)行曝光檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平15。1.5 主要觀察指標(biāo) 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果；型膠原的定性檢測(cè)結(jié)果；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SOX9、Col1a1和Col2a1 mRNA的表達(dá)；Western-blot檢測(cè)SOX9、型膠原和型膠原蛋白表達(dá)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)

34、據(jù)進(jìn)行進(jìn)行OneWay ANOVA分析，P 0.05表示差異具有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的結(jié)果顯示， 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD105和CD73，低表達(dá)CD34和CD45(圖1)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)特性。 2.2 型膠原的定性檢測(cè)結(jié)果 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組免疫熒光染色呈陰性，而人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和共培養(yǎng)組的細(xì)胞染色均呈陽性，胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)均呈現(xiàn)紅色熒光(圖2)，共培養(yǎng)組的熒光信號(hào)最強(qiáng)，且組內(nèi)無明顯差異。 2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SOX9、Col1a1和Col2a1 m

35、RNA表達(dá) 共培養(yǎng)組的SOX9 mRNA表達(dá)量均高于陽性對(duì)照組(P 0.05)，31共培養(yǎng)組相對(duì)表達(dá)量最高(P 0.05)。另外，空白對(duì)照組的SOX9 mRNA表達(dá)量均低于陽性對(duì)照組(P 0.05)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組的表達(dá)量最低(P 0.05)(圖3A)。圖1 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物檢測(cè)Figure 1 Surface marker detection of human umbilical cord mesenchymal stem cells圖注：圖中A為靶細(xì)胞區(qū)域；B為IgG1-PE和IgG1-FITC被用來作非特異性結(jié)合的控制；C為CD34-PE 和 CD45-FITC；D為CD

36、105-PE和CD73-FITC。 AD CBDAPICOLIIMerge A B C D E F圖2 軟骨細(xì)胞免疫熒光鑒定(100)Figure 2 Immunofluorescence identification of human articular chondrocytes (100)圖注：圖A為人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照；B為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照；C為陽性對(duì)照；D為11培養(yǎng)組；E為31培養(yǎng)組；F為51培養(yǎng)組。80070060050040030020010005.04.54.03.53.02.52.01.51.00SOX9相對(duì)表達(dá)Col1a1相對(duì)表達(dá)Col2a1相對(duì)表達(dá)ababaaa

37、abaa1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6aabababa1.21.00.20ACBab1 2 3 4 5 6圖3 SOX9、Col1a1和Col2a1 mRNA表達(dá)量Figure 3 Expression of SOX9, Col1a1 and Col2a1 mRNA圖注：1：人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照；2：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照；3：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性對(duì)照；4，5，6：分別為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)11，31，51組。共培養(yǎng)組的SOX9 mRNA表達(dá)量均高于陽性對(duì)照組(P 0.05)，31共培養(yǎng)組相對(duì)表達(dá)量最高(P 0.05)；31共培養(yǎng)

38、組的Col1a1 mRNA表達(dá)量比陽性對(duì)照組高(P 0.05)；共培養(yǎng)組中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比例增加，Col2a1 mRNA表達(dá)量降低(P 0.05)。與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白組比較，aP 0.05；與陽性對(duì)照組對(duì)照組比較，bP 0.05)，但31共培養(yǎng)組的Col1a1 mRNA表達(dá)量比陽性對(duì)照組高(P 0.05)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組的Col1a1 mRNA表達(dá)量最低 (P 0.05)，人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組的Col1a1 mRNA表達(dá)量最高(P 0.05)(圖3B)。與空白對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組和陽性對(duì)照組的Col2a1 mRNA表達(dá)量較高(P 0.05)，其中陽性對(duì)照組表達(dá)最高，人臍

39、帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組表達(dá)量最低(P 0.05)。 共培養(yǎng)組中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比例增加，Col2a1 mRNA表達(dá)量降低(P 0.05)(圖3C)。2.4 Western-blot檢測(cè)SOX9、型膠原和型膠原蛋白表達(dá) 共培養(yǎng)組SOX9 蛋白表達(dá)量高于陽性對(duì)照組，且組內(nèi)無明顯差異。人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組SOX9 蛋白表達(dá)量最高，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組SOX9 蛋白表達(dá)量最低(圖4)。共培養(yǎng)組型膠原蛋白表達(dá)量略高于陽性對(duì)照組，且組內(nèi)無明顯差異。陽性對(duì)照組和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組無明顯型膠原蛋白表達(dá)，而人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組型膠原蛋白表達(dá)量最高。 與空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組相比，

40、共培養(yǎng)組型膠原蛋白表達(dá)量較高，且組內(nèi)無明顯差異。3 討論 Discussion體外大量擴(kuò)增軟骨細(xì)胞是構(gòu)建組織工程化軟骨的一個(gè)關(guān)鍵步驟，在體外擴(kuò)增過程中，軟骨細(xì)胞容易發(fā)生去分化，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型喪失16-22。軟骨細(xì)胞去分化后產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)以I型膠原為主，與型膠原相比，其機(jī)械強(qiáng)度、彈性模量等力學(xué)性能明顯降低23-24。因此，如何避免軟骨細(xì)胞去分化，維持軟骨細(xì)胞表型成為軟骨組織工程領(lǐng)域亟需解決的問題。已有大量的研究表明，利用共培養(yǎng)技術(shù)可為軟骨組織工程提供優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞，如通過人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)有望解決種子細(xì)胞的供應(yīng)問題。首先，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD73和CDl05，低表達(dá)C

41、D34和CD45，鏡下形態(tài)呈纖維細(xì)胞樣，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特性25-28，還可分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖29。其次，軟骨細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子等30-32，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化，并分泌甲狀旁腺素相關(guān)蛋白抑制間充質(zhì)干細(xì)胞在分化過程中肥大化33。羅二梅等34利用Transwell體系將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按14，13，12，11，21，31及41(人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)的比例共培養(yǎng)，21 d后發(fā)現(xiàn)原人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光反應(yīng)均呈陽性，且GAG、型膠原含量及mRNA表達(dá)量

42、14實(shí)驗(yàn)組均要高于其他實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組，研究表明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的間接共培養(yǎng)可明顯促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，且最佳間接共培養(yǎng)比例為14。Zuo等35將大鼠的軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2:1比例在體外分別直接和間接共培養(yǎng)3周后用流式細(xì)胞儀分離，通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，直接共培養(yǎng)組中軟骨細(xì)胞的SOX-9、型膠原、聚集蛋白聚糖(aggrecan) mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于間接共培養(yǎng)組中軟骨細(xì)胞的表達(dá)水平，并在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，研究表明直接共培養(yǎng)比間接共培養(yǎng)更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。然而，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共

43、培養(yǎng)的最佳比例仍未確定。實(shí)驗(yàn)將人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外直接共培養(yǎng)28 d，免疫熒光檢測(cè)型膠原表達(dá)，共培養(yǎng)組均呈陽性，且組內(nèi)無明顯差異，共培養(yǎng)組熒光強(qiáng)度比陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組強(qiáng)，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞空白對(duì)照組熒光染色呈陰性，提示直接共培養(yǎng)可誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，51共培養(yǎng)組可大量縮減軟骨細(xì)胞用量，并達(dá)到較為理想的誘導(dǎo)效果。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示共培養(yǎng)組和陽性對(duì)照組的SOX9 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組有明顯升高，31共培養(yǎng)組最突出；共培養(yǎng)組和陽性對(duì)照組的型膠原mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組有明顯升高，陽性對(duì)照組最突出，提示共培養(yǎng)和藥物誘導(dǎo)均可促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)

44、胞分化。Western-blot檢測(cè)顯示共培養(yǎng)組的SOX9和型膠原蛋白表達(dá)較陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組有明顯提高，且組內(nèi)無明顯差異，提示共培養(yǎng)可促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化， 51共培養(yǎng)組可節(jié)省軟骨細(xì)胞用量，并產(chǎn)生理想的誘導(dǎo)效果。上述結(jié)果提示共培養(yǎng)可有效促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞直接共培養(yǎng) 28 d后，免疫熒光檢測(cè)型膠原表達(dá)，共培養(yǎng)組的熒光強(qiáng)度比人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組強(qiáng)，提示直接共培養(yǎng)有利于維持軟骨細(xì)胞表型。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示共培養(yǎng)組和陽性對(duì)照組的型膠原A1 mRNA表達(dá)受到明顯抑制，而人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞空白對(duì)照組的型膠原A1 mRNA表達(dá)水

45、平明顯升高，提示共培養(yǎng)和藥物誘導(dǎo)均可抑制人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化，利于維持軟骨細(xì)胞表型。Western-blot檢測(cè)顯示共培養(yǎng)組和陽性對(duì)照組的型膠原蛋白表達(dá)水平較低，而人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 空白對(duì)照組的型膠原蛋白表達(dá)水平較高，提示共培養(yǎng)和藥物誘導(dǎo)均可有效抑制人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化，維持軟骨細(xì)胞表型。上述結(jié)果提示共培養(yǎng)可有效抑制軟骨細(xì)胞去分化，維持軟骨細(xì)胞表型。結(jié)論：研究結(jié)果提示一定比例的直接共培養(yǎng)可明顯增強(qiáng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的能力，且有效抑制細(xì)胞纖維化，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)的適宜比例或?yàn)?1。然而，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)

46、計(jì)為第一作者和通訊作者，實(shí)施為全體作者，第一作者成文，通訊作者審校，盲法評(píng)估。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：新生兒臍帶取自深圳市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦，產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)；人關(guān)節(jié)軟骨均由深圳市第二人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科提供，自愿者及其家屬均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：文章第一作者對(duì)研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按

47、照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。根據(jù)知識(shí)共享許可協(xié)議“署名-非商業(yè)性使用-相同方式共享3.0”條款，在合理引用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴(kuò)展，同時(shí)允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級(jí)鏈接該文獻(xiàn)，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。4 參考文獻(xiàn) References1 van Osch GJ, Brittberg M, Dennis JE,et al.Cartilage rep

48、air: past and future-lessons for regenerative medicine.J Cell Mol Med.2009;13(5):792-810.2 Izadifar Z, Chen X, Kulyk W. Strategic Design and Fabrication of Engineered Scaffolds for Articular Cartilage Repair. J Funct Biomater.2012;3(4):799-838.3 Duan L, Ma B, Liang Y, et al. Cytokine networking of c

49、hondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res.2015;7(2): 194-208.4 Lindenmair A, Hatlapatka T, Kollwig G, et al. Mesenchymal Stem or Stromal Cells from Amnion and Umbilical Cord Tissue and Their Potential for Clinical Applications. Cells

50、. 2012; 1(4):1061-1088. 5 Bieback K, Brinkmann I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells.2010;2(4):81-92.6 Barberini DJ, Freitas NP, Magnoni MS, et al. Equine mesenchymal stem cells from bone marrow,adipose tissue and umbilical cord:

51、immunophenotypic characterization and differentiation potential. Stem Cell Res Ther.2014;5(1):25. 7 Yang YH1, Lee AJ, Barabino GA. Coculture-Driven Mesenchymal Stem Cell- Differentiated Articular Chondrocyte-Like Cells Support Neocartilage Development. Stem Cells Transl Med.2012;1(11):843-854.8 Levo

52、rson EJ, Santoro M, Kasper FK, et al. Direct and Indirect Co-culture of Chondrocytes and Mesenchymal Stem Cells for the Generation of Polymer/Extracellular Matrix Hybrid Constructs. Acta Biomater.2014;10(5):1824-1835.9 Leyh M, Seitz A, Drselen L, et al. Osteoarthritic cartilage explants affect extra

53、cellular matrix production and composition in cocultured bone marrow-derived mesenchymal stem cells and articular chondrocytes.Stem Cell Res Ther.2014;5(3):77. 10 Cooke ME, Allon AA, Cheng T, et al.Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis Cartilage.2011;19(10): 1210-1218.11 Leyh M, Seitz A, Drselen L, et al. Subchondral bone influences