小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析方法的研究進(jìn)展

1、第3期詹屋強(qiáng), 等: 小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析方法的研究進(jìn)展5小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析方法的研究進(jìn)展詹屋強(qiáng), 王 弘*(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 廣東省教育廳食品質(zhì)量安全重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642)摘 要: 自免疫分析技術(shù)問世以來, 出現(xiàn)了多種快速檢測產(chǎn)品如elisa試劑盒、免疫層析試紙條, 但是目前的快速檢測試劑盒普遍存在檢測靈敏度低、線性范圍窄、易出現(xiàn)假陽性等問題。為解決這些問題, 科研工作者發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)在檢測中顯示出許多特點(diǎn), 而這些特點(diǎn)正是研究開發(fā)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵, 小分子物質(zhì)的快速檢測已占據(jù)越來越重要地位。本文歸納國內(nèi)外小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究成果, 總結(jié)小分子物質(zhì)

2、酶聯(lián)免疫分析方法的內(nèi)容及特點(diǎn), 介紹小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析方法中抗原制備特點(diǎn), 分析小分子物質(zhì)檢測中抗體種類及特性, 重點(diǎn)比較酶聯(lián)免疫分析方法中直接和間接競爭法, 并分析非競爭法在小分子物質(zhì)檢測中優(yōu)勢, 旨在為今后免疫學(xué)快速檢測技術(shù)的研究與開發(fā)提供幫助。關(guān)鍵詞: 小分子物質(zhì); 酶聯(lián)免疫分析; 競爭法; 非競爭法research progress on enzyme-linked immunoassay for small molecules substanceszhan wu-qiang, wang hong*(guangdong provincial key laboratory of fo

3、od quality and safety, college of food science, southchinaagriculturaluniversity, guangzhou 510642, china)abstract: since immunoassy technology was developed, detectiveproducts such as elisa kit, immune chromatography strips hadbeen invented, but the current production of rapid detection kit showed

4、alow detection sensitivity, with a narrow linear range and high false positive rate. to solve these problems, researchers found that smaller molecules showed many characteristics when detected, and these characteristics werethe key to research and develop enzyme-linked immunoassy technology. rapidqu

5、antifysmall molecules occupied an important position in rapid detection.in this paper, domestic and foreign research achievements about enzyme-linked immunoassay technology were summarized. the content and characteristics of detection method of small molecule base on enzyme-linked immunoassay were r

6、eviewed. the characteristics and research status of antigen preparation of the small molecular substances based on elisa were introduced. meanwhile, the direct and indirect competition of enzyme-linked immunoassay methods were compared and advantage of noncompetitive enzyme linked immunoassay method

7、 for the detection of small molecular substances was analyzed. the purpose is to assist research and development of enzyme-linked immunoassay method of small molecules.key words: small molecules substances; enzyme-linked immunoassay; competition; noncompetition抗原-抗體免疫分析技術(shù)問世以來, 針對(duì)快速檢測小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析(enzy

8、me- linked immunoassay, elisa)技術(shù)的研究從未曾間斷。酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的應(yīng)用始于醫(yī)學(xué)臨床檢測毒素和葡萄球菌腸毒素1。1987年, ross等將elisa應(yīng)用于檢測脫落酸2。1994年, yang等人將elisa應(yīng)用于檢測植物中的細(xì)胞分裂素3。同年, ibrahim4等采用雜交瘤技術(shù)制備對(duì)硫磷特異性單克隆抗體, 并使用elisa技術(shù)檢測其含量, 實(shí)現(xiàn)了將elisa應(yīng)用到小分子有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。2005年, 劉仁榮等將競爭性elisa法應(yīng)用于赭曲霉毒素a5。2011年, 王雨晨等將間接競爭elisa法應(yīng)用于伏馬毒素b16。目前為止, 針對(duì)重金屬如鎘(cd)、汞(hg

9、)等酶聯(lián)免疫的分析方法已經(jīng)建立7,8。2014年, wu9等報(bào)道可樂添加物中具有致癌性的4-甲基咪唑的間接競爭elisa檢測法。市場上出現(xiàn)了各類快速檢測產(chǎn)品如elisa試劑盒、免疫層析試紙條, 但是目前快速檢測試劑盒普遍存在檢測靈敏度低、線性范圍窄、易出現(xiàn)假陽性等問題。為解決這些問題, 科研工作者發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)在檢測中顯示出許多特點(diǎn), 而這些特點(diǎn)正是研究開發(fā)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵。首先, 小分子物質(zhì)分子量小, 不具備免疫原性, 不能使動(dòng)物直接產(chǎn)生抗體, 需要先合成半抗原再與大分子蛋白偶聯(lián)才能成為免疫原。其次, 基于快速檢測的這種抗原-抗體的反應(yīng)模式, 小分子物質(zhì)與抗體結(jié)合后, 其大部分表面積被

10、包裹, 不能與另一種抗體結(jié)合, 限制了小分子抗體的雙抗夾心法的應(yīng)用10?？梢? 競爭法是小分子物質(zhì)檢測中研究最多的。因此, 本文比較直接競爭法和間接競爭法的研究特點(diǎn)并進(jìn)行總結(jié), 為今后進(jìn)行elisa研究提供思路。此外, 基因工程抗體、噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展, 抗體體積大大縮小, 基于“抗體-抗原-抗體”模式建立的非競爭法是一種新型檢測方法。1 酶聯(lián)免疫分析方法的人工抗原合成和抗體種類酶聯(lián)免疫分析方法是通過抗原和抗體特異性反應(yīng)及酶與底物顯色反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物快速靈敏檢測的一種方法。因此人工抗原合成及抗體選擇是酶聯(lián)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。1.1 人工抗原合成過去30年, 人們在小分子半抗原合成中偶聯(lián)點(diǎn)、抗

11、原決定簇選擇、探索可行化學(xué)合成方法等方面進(jìn)行大量研究, 制備農(nóng)藥分子人工抗原已經(jīng)取得一些進(jìn)展。小分子物質(zhì)(分子質(zhì)量小于1000 u)不具備免疫原性, 需要與大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)合成人工抗原, 并誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體才能產(chǎn)生抗體。人工抗原由半抗原與大分子蛋白偶聯(lián)形成, 多數(shù)小分子物質(zhì)如農(nóng)藥小分子, 需經(jīng)過衍生化作用合成半抗原, 一般在有機(jī)小分子上引入帶有偶聯(lián)基團(tuán)(如-nh2、-no2、-cooh、-oh)的化合物, 有時(shí)這些化合物還需具有一定復(fù)雜結(jié)構(gòu)(分支結(jié)構(gòu)、苯環(huán)或雜環(huán))11。而如果被檢測的是重金屬, 則引入螯合劑合成半抗原。半抗原合成直接影響后期制備抗體質(zhì)量, 是酶聯(lián)免疫檢測方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。1.2

12、特異性抗體種類抗體親和力和特異性是建立elisa的必備條件, 用于檢測的抗體主要分為多克隆抗體、單克隆抗體及基因工程抗體。多克隆抗體容易制備, 在酶聯(lián)免疫分析檢測中用廣泛, 但是特異性不夠強(qiáng), 個(gè)體差異大, 不利于免疫分析方法標(biāo)準(zhǔn)化。單克隆抗體具有較好特異性, 近幾年有關(guān)研究很多, 但是制備復(fù)雜、耗時(shí)、成本高和效率低?；蚬こ炭贵w具有可塑性強(qiáng)、無需動(dòng)物免疫即可批量生產(chǎn)等特點(diǎn)。目前基因工程抗體包括人-鼠嵌合抗體、改型抗體、雙特異性抗體、小分子抗體等。所謂小分子抗體是指相對(duì)分子質(zhì)量較小但具有抗原結(jié)合功能的抗體分子片段,包括fab、fv、scfv等, 其中fab和scfv是目前小分子抗體研究的重點(diǎn)。

13、emma12等通過構(gòu)建重組抗體scfv, 利用elisa法檢測氟醚唑, 得到最低檢測限為1 ng/ml。但是won13, mara-jos14等發(fā)現(xiàn)單鏈抗體scfv親和力比單克隆抗體低。此外, scfv穩(wěn)定性不強(qiáng), 它和融合蛋白甚至?xí)l(fā)生聚集沉淀15。但是, 隨著基因工程抗體技術(shù)如抗體克隆、抗體基因組合文庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)及抗體改型技術(shù)發(fā)展, 基因工程抗體已然成為檢測應(yīng)用新寵。2 直接競爭和間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)按照抗原-抗體反應(yīng)模式, 可分為競爭法、非競爭法。競爭法又分為直接競爭法( direct competitive-elisa, dc-elisa)和間接

14、競爭法(indirect competitive-elisa, ic-elisa )。直接競爭方法是將抗體固定, 然后加入酶標(biāo)抗原與被檢測物競爭, 被檢測物濃度高時(shí), 酶標(biāo)抗原結(jié)合固定抗體的量就低, 反之, 酶標(biāo)抗原結(jié)合固定抗體的量就高。底物顯色程度用od值表征, 因此根據(jù)od值的大小能得到被檢測物濃度。間接競爭法是將人工包被抗原固定, 加入抗體和被分析物的混合物, 當(dāng)被分析物濃度高時(shí), 結(jié)合到固定抗原的抗體就少, 再加入酶標(biāo)抗體, 加入底物顯色, 亦能根據(jù)od值大小得到被檢測物濃度。直接競爭法和間接競爭法兩種方法各有優(yōu)勢, 相對(duì)于間接競爭法來說, 直接競爭法用時(shí)短, 但是兩種方法的靈敏度高低

15、根據(jù)物質(zhì)不同有所不同。kolosova16等利用單克隆抗體對(duì)甲基對(duì)硫磷分別進(jìn)行直接、間接競爭酶聯(lián)免疫測定, ic-elisa對(duì)甲基對(duì)硫磷最低檢出限為0.08 ng/ml, 所需時(shí)間3.5 h; dc-elisa法最低檢出限 0.5 ng/ml, 其所需時(shí)間僅1. 5h。而kim17等用單克隆抗體對(duì)吡蟲啉建立直接、間接elisa, ic-elisa得到的ic50值和檢測限為0.8和0.1 g/l, dc-elisa得到的ic50值和檢測限為0.3和0.03 g/l。實(shí)際上在小分子物質(zhì)檢測中, 間接競爭法多于直接競爭法, 其原因可能是直接競爭法需要將藥物或半抗原與酶偶聯(lián), 而這種偶聯(lián)物不穩(wěn)定, 多

16、次使用會(huì)使其靈敏度降低。近年來, 很多學(xué)者因直接競爭法用時(shí)少而備受關(guān)注, 吳璟等采用直接競爭法對(duì)食物中丙烯酰胺檢測, 檢出限為3.0 g/l,線性范圍為9.2195 g/l, 表明本法可用于食品中丙烯酰胺的快速檢測18。李瑞婷等應(yīng)用直接競爭法檢測保健食品中西地那非, 該方法半抑制濃度ic50為1.47 ng/ml,線性范圍(ic20ic80)為0.1217.65 ng/ml,檢測限ic15達(dá)到0.0845 ng/ml19。競爭性酶聯(lián)免疫分析檢測法以其靈敏、快速、能直觀反應(yīng)被測小分子有害物質(zhì)濃度而在霉菌毒素、農(nóng)藥小分子、激素及重金屬物質(zhì)中應(yīng)用廣泛, 見表1。表1 競爭性酶聯(lián)免疫分析方法在小分子物

17、質(zhì)檢測當(dāng)中的的應(yīng)用table 1 application of competitive enzyme linked immunoassay for small molecular substances detection分類有害物質(zhì)名稱測定方法抗體類型檢測樣本檢測限/線性范圍年限參考文獻(xiàn)毒素類黃曲霉毒素ic-elisam牛奶3 ng/l2011 20t-2毒素ic-elisam水稻5.80 ng/kg2014 21赭曲霉毒素adc-elisam無花果干0.18 ng/ml2012 22伏馬毒素b1ic-elisam玉米1.0 ng/ml2014 23農(nóng)藥類氯蟲苯甲酰胺ic-elisam-0.1

18、8 ng/ml2014 24百草枯elisap小麥大麥土豆(0.0370.01) g/kg(0.710.3) g/kg(0.560.1) g/kg2014 25苯噻菌酯ic-elisam-0.4287.55 ng/l2014 26聯(lián)苯菊酯ic-elisap土壤0.004 mg/l2015 27殺菌劑百菌清dc-elisam蔬菜0.16.0 ng/ml2014 28重金屬鎘ic-elisam水、土壤、油菜0.240 ng/ml2012 7鎘dc-elisam_0.3 g/ml2007 8汞ic-elisam水、牛奶、青菜0.1100 ng/ml2012 29飼料中添加物克倫特羅dc-elisap

19、-0.13 ng/l、0.11000 g/l2011 30萊克多巴胺dc-elisap尿、血清、肉0.3 ng/kg2013 31苯乙醇胺ic-elisap-0.03 ng/ml2013 32食品中非法添加鄰苯二甲酸二環(huán)己酯dc-elisap液態(tài)食品0.1100 ng/ml2014 33氯吡脲dc-elisam獼猴桃和葡萄10 ng/l2012 34三(2,3-二溴丙基)異氰脲酸酯ic-elisam_0.06 g/l2014 35帽柱木堿ic-elisam_32.92250 mg/ml2014 36注: “p”表示多克隆抗體; “m”表示單克隆抗體; “”表示文獻(xiàn)信息不詳; “ic-elisa

20、”表示間接競爭elisa法; “dc-elisa”表示直接競爭elisa法。3 非競爭性酶聯(lián)免疫分析法傳統(tǒng)雙抗夾心法只能檢測蛋白質(zhì)、多糖等具有多個(gè)抗原表位的大分子物質(zhì), 限制了小分子物質(zhì)的使用37。國內(nèi)外學(xué)者不斷努力開發(fā)新型“抗體-抗原-抗體”的雙抗夾心檢測模式, 且多傾向于研究以下兩種方法。開放夾心式免疫法(open sandwich immunoassay, osia), 利用抗體可變區(qū)片段vh和vl代替夾心法的兩種抗體, vh和vl之間作用力很弱, 抗原存在能顯著增強(qiáng)兩者相互作用, 且當(dāng)這種增強(qiáng)作用越大靈敏度越好。yuko38等將os-ia運(yùn)用于麻痹性貝類毒素得到檢測范圍為0.11000

21、 ng /ml, 比普通elisa的檢測范圍更寬。masaki等39將op-elisa與微流控芯片傳感裝置結(jié)合, 12 min檢測小分子人骨鈣素, 檢測限達(dá)到1 g/ml。這種方法完全避免反復(fù)孵育和洗滌過程, 縮短了檢測時(shí)間。噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法(phage anti-immune complex assay, phaia), 抗原和抗體結(jié)合后, 大于85%的抗原表面積被包埋, 只有極小部分與抗體形成異型表位, 而單克隆抗體對(duì)此并不識(shí)別。人們卻發(fā)現(xiàn)能識(shí)別抗原抗體復(fù)合物的噬菌體展示短肽, 從而發(fā)展出了phaia。dong49等利用噬菌體展示肽庫篩選出能識(shí)別免疫復(fù)合物的具有8個(gè)氨基酸的噬菌體展

22、示肽, 并建立隱形孔雀石綠(lmg)的phaia, 其檢測限和sc50分別為0.55 ng/ml和7.02 ng/ml, 靈敏度比競爭法有所提高。mariana 41等發(fā)展phaia, 利用噬菌體展示技術(shù)得到抗免疫復(fù)合物多肽后與鏈霉親和素融合成重組嵌合體, 用于檢測除草劑廣滅靈, 得到檢測限和sc50值分別為0.48 ng/ml和(2.20.3) ng/ml, 分別是該抗體建立的競爭性分析方法檢測限和sc50的8和13倍, 該方法建立了一種無需噬菌體參與的檢測模式。圖1 開放式夾心免疫法圖2 噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法fig. 1 assay of open sandwich immune fi

23、g. 2 assay of phage anti-immune complex4 結(jié)論與展望為提高酶聯(lián)免疫反應(yīng)靈敏度、準(zhǔn)確度、檢測效率, 不斷對(duì)其進(jìn)行創(chuàng)新發(fā)展。如化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法、生物素-親和素放大的酶聯(lián)免疫分析法等。ivanova42等將用磁性納米顆粒固定抗孕酮抗體檢測牛奶樣品中的孕酮, 得到檢測檢測限低至0.09 ng/ml, 管笛43等引入超順磁微粒, 將羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物替代酶標(biāo)板后, 用直接競爭酶聯(lián)免疫法檢測玉米中伏馬毒素b1, 結(jié)果具有更低檢出限。由于磁微粒能夠提供更大比表面積和更好流動(dòng)性, 能夠避免空間位阻, 使抗原抗體在液相中呈三維立體反應(yīng), 因此相較常規(guī)酶標(biāo)板, 可使

24、反應(yīng)靈敏度得到提升。小分子抗體因其可人工改造、大量生產(chǎn)特點(diǎn), 近年來受到食品藥品小分子物質(zhì)檢測研究人員親睞, 但是多數(shù)重組抗體的穩(wěn)定性和親和力會(huì)稍遜于單克隆抗體, 其可能原因是抗體恒定區(qū)缺失、異源細(xì)胞表達(dá)后抗體不能有效折疊等。現(xiàn)代小分子抗體研究過程中, 如果想要得到高質(zhì)量抗體, 采用分子模擬技術(shù)模擬抗體結(jié)構(gòu), 為改變抗體基因提供依據(jù)是目前用于檢測小分子抗體的發(fā)展方向。非競爭免疫分析方法近幾年開始發(fā)展, 國內(nèi)鮮有報(bào)道。與競爭酶聯(lián)免疫法相比, 非競爭法除具有更高靈敏度、精確度、線性范圍外, 其分析物含量與檢測信號(hào)在競爭型免疫分析中呈正相關(guān)10。此外, 非競爭法更適用于現(xiàn)場檢測模式, 如結(jié)合微流控芯

25、片技術(shù)和生物傳感法, 或者制作纖維試紙條和免疫色譜分析37。因此, 非競爭法應(yīng)用于檢測試劑盒、纖維試紙條是未來發(fā)展趨勢。參考文獻(xiàn)1 noterotoxin s, verjans hl, bol j, et al. enzyme linked immunesorbent assay (elisa) for determination of staphylococcus aureus enterotoxin type b j. health lab sci, 1978, 15(1): 28-31.2 ross gs, elder p a,mcwha ja, et al. the developme

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