生物化學教學課件：第14章 DNA的生物合成

1、目目 錄錄第三篇遺傳信息的傳遞目錄目錄目錄目錄蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNARNAFrancis Crick (1916-2004 )DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis (Replication) 第第 十四十四 章章1. DNA復制（復制（DNADNA）2. 逆轉錄逆轉錄 ( RNADNA)復制復制( (replication)以母鏈以母鏈DNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNA的過程。的過程。DNADNA復制的基本特征復制的基本特征Basic Rules of DNA Replication 第一節(jié)第一節(jié)目錄目錄半保留復制半保留復制semi-conservative repli

2、cation半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制semi-discontinuous replication雙向復制雙向復制bidirectional replication復制的基本特征復制的基本特征 semi-conservative replication半保留復制的概念半保留復制的概念含含15N-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液培養(yǎng)液(14N) 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代 實驗結果支持實驗結果支持半保留復制半保留復制的設想。的設想。15N-DNA14N-DNA實驗證據(jù)實驗證據(jù)（同位素（同位素標記技術、密度梯度離心）標記技術、密度梯度離心）1958

3、年年Matthew Messelson和和Franklin Stahl遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但但不是絕對的不是絕對的。半保留復制的意義半保留復制的意義 按按半保留復制方式，子代半保留復制方式，子代DNA與與親代親代DNA的的堿基序列一致堿基序列一致，即，即 子代子代保留了親代的全部遺保留了親代的全部遺傳信息傳信息，體現(xiàn)了遺傳的，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性 。起點起點起點原核生物DNA的雙向復制原核生物復制時，原核生物復制時，DNA從從起始點起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉

4、，稱為復制叉，稱為雙向復制雙向復制。 二、二、DNA復制從起點向兩個方向延伸復制從起點向兩個方向延伸53oriorioriori5355335533復制子復制子已完成復制的復制子已完成復制的復制子復復制制進進程程目錄目錄3 5 3 5 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向領頭鏈領頭鏈(leading strand)隨從鏈隨從鏈(lagging strand)3 5 三、三、DNA復制反應呈半不連續(xù)特征復制反應呈半不連續(xù)特征子鏈沿母鏈模板復制，只能從子鏈沿母鏈模板復制，只能從5 5向向3 3延伸。延伸。同一個同一個上只能有一個解鏈方向。上只能有一個解鏈方向。半不延續(xù)復制半不延續(xù)復制順著解鏈方向生成的

5、子鏈，復制是連續(xù)進行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為這股鏈稱為領頭鏈（領頭鏈（leading strand）。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為為隨從鏈（隨從鏈（lagging strand）。復制中的不連續(xù)片。復制中的不連續(xù)片段稱為段稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性半不連續(xù)性(semi-discontinuou

6、s Replication)。 DNA復制的酶學和拓樸學變化復制的酶學和拓樸學變化The Enzymology and Topology of DNA Replication第二節(jié)第二節(jié)參與參與DNA復制的物質(zhì)復制的物質(zhì)參與參與DNA復復制的物質(zhì)制的物質(zhì)dNTPDNA-pol解成單鏈的解成單鏈的DNA母鏈母鏈與模板互補的與模板互補的RNA片段片段底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶簡寫簡寫 為為 DNA-pol模板模板(template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈

7、母鏈引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端末端使使dNTP可以依可以依次聚合次聚合解螺旋酶解螺旋酶引物酶引物酶單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白DNA連接酶等連接酶等復制的基本化學反應復制的基本化學反應特點：特點：需要需要引物引物和和模板模板； 新鏈的延長新鏈的延長5 3 方向方向PPiHOP PPG5 端端3 端端CGA一、一、DNA聚合酶催化脫聚合酶催化脫氧核苷酸之間聚合氧核苷酸之間聚合全稱：依賴全稱：依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase ) (DNA-directed DNA polymerase)縮寫：縮寫：DNA-pol

8、 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶聚合酶1959 年獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎年獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 奧喬亞奧喬亞 科恩伯格科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg（一）原核生物有（一）原核生物有3種種DNA聚合酶聚合酶目目 錄錄個核心酶個核心酶1個個 -復合物（復合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞基）基）1對對 -亞基（可滑動亞基（可滑動的的DNA夾子）夾子）DNA聚合酶聚合酶全酶結構全酶結構全酶結構包括：全酶結構包括：目目 錄錄 亞基亞基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亞基亞基具有

9、具有35 外切酶活性（復制外切酶活性（復制保真性所必需）保真性所必需） 亞基可增強亞基可增強其活性其活性 亞基亞基可能起組裝作用可能起組裝作用核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成：兩側的兩側的 亞基發(fā)揮夾穩(wěn)亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNADNA模板鏈，并使酶模板鏈，并使酶沿模板滑動的作用沿模板滑動的作用目目 錄錄2個個 -亞基亞基分別和分別和1個核心酶相互作用，其個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在柔性連接區(qū)可以確保在復制叉復制叉1個全酶分子的個全酶分子的2個核心酶能夠個核心酶能夠相對獨立相對獨立運動運動，分別負責合成前分別負責合成前導鏈和后隨鏈導鏈和后隨鏈。功能：功能：有促進全酶組裝至模板上

10、有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用及增強核心酶活性的作用 -復合物由復合物由6種亞基組成：種亞基組成： 、 、 、 、 、 目錄目錄小片段小片段大片段大片段/Klenow 片段片段 N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA，進，進行分子生物學研究中常用的工具酶。行分子生物學研究中常用的工具酶。 NC大片段（大片段（Klenow片段）片段） DNA-pol （109kD） DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高對模板的特異性不高，即

11、使在已發(fā)生，即使在已發(fā)生損傷的損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與此認為，它參與DNA損傷的損傷的應急狀態(tài)修復應急狀態(tài)修復。真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 E.Coli真核細胞真核細胞 功能功能填補復制中的填補復制中的DNA空隙，空隙，DNA修復和修復和重組重組復制中的校對，復制中的校對，DNA修復修復 DNA修復修復 線粒體線粒體DNA合成合成 錯配修復錯配修復 引物酶引物酶 前導鏈和后隨鏈合成，錯配修復前導鏈和后隨鏈合成，錯配修復目錄目錄2. 酶在復制延長時酶在復制延長時對堿基的選擇功能對堿基的選擇功

12、能1. 遵守嚴格的遵守嚴格的堿基配對規(guī)律堿基配對規(guī)律3.復制出錯時酶的復制出錯時酶的及時校讀功能及時校讀功能DNA復制的復制的保真性保真性至少要依賴至少要依賴三種機制三種機制 二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和聚合酶的堿基選擇和 校對功能實現(xiàn)復制的保真性校對功能實現(xiàn)復制的保真性三、復制中的解鏈伴有三、復制中的解鏈伴有DNA 分子拓撲學變化分子拓撲學變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把把DNA解成單鏈后，它才能起模板作用。解成單鏈后，它才能起模板作用。理順理順DNA鏈鏈拓撲異構酶拓撲異構酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結合蛋

13、白結合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認起始點辨認起始點DnaA (dnaA)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復制起始的相關蛋白質(zhì)原核生物復制起始的相關蛋白質(zhì)（一）多種酶參與（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)利用利用ATP供能，在復制叉前解開一小段供能，在復制叉前解開一小段DNA1.解螺旋酶解螺旋酶 (helicase) ：3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶 該酶以該酶以DNA為模板

14、，為模板，2.2.引物酶( (primerase) )3 5 3 5 3.單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(SSB) 單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白對單鏈對單鏈DNA有高親和力，能特有高親和力，能特異地結合到分開的單鏈異地結合到分開的單鏈DNA上。上。 在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整解鏈過程中，解鏈過程中，在在解開的兩條單鏈解開的兩條單鏈DNA分子的分子的前前方方會出現(xiàn)過度會出現(xiàn)過度擰緊擰緊、打結打結、纏繞纏繞和和連環(huán)連環(huán)等現(xiàn)象。等現(xiàn)象。（二）（二）DNA拓撲異構酶改變拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態(tài)超螺旋狀態(tài)拓撲異構酶的作用：拓撲異構酶的

15、作用：拓拓 撲撲 異異 構構 酶酶 對螺旋的作用對螺旋的作用松弛松弛 克服扭結克服扭結 斷端沿螺旋軸松斷端沿螺旋軸松解的方向移動解的方向移動斷端沿螺旋軸松斷端沿螺旋軸松解的方向移動解的方向移動有有ATP 進入負超進入負超螺旋螺旋 解螺旋酶和拓撲異構酶的聯(lián)合作用：解螺旋酶和拓撲異構酶的聯(lián)合作用：DNA雙鏈解成單鏈。雙鏈解成單鏈。555四四.DNA.DNA連接酶連接復制中產(chǎn)生的單鏈缺口連接酶連接復制中產(chǎn)生的單鏈缺口DNA連接酶連接酶原核生物原核生物DNADNA復制過程復制過程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第三節(jié)第三節(jié)需要解決兩個問題：需要

16、解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，解開成單鏈，提供模板提供模板。2. 形成引發(fā)體，合成引物，形成引發(fā)體，合成引物，提供提供3 -OH末端末端。一、復制的起始一、復制的起始 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列串聯(lián)重復序列 反向重復序列反向重復序列5 3 5 3 （一）（一）

17、DNA解鏈解鏈目錄目錄 Dna B、 Dna CDNA拓撲異構酶拓撲異構酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和引發(fā)體形成（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。解解螺螺旋旋酶酶目錄目錄3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶n引物引物是由引物酶催化合成的短鏈是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。n在領頭鏈（模板）上，在領頭鏈（模板）上，引物酶（引物酶（DnaG）與）與解螺旋酶（解螺旋酶（DnaB）結合成復合物）結合成復合物解鏈及解鏈及引物合成引物合

18、成引物引物酶酶 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol III復制的延長指在復制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 二、二、DNA鏈的延長鏈的延長復制的延長復制的延長復復制制過過程程簡簡圖圖5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP AMP+PPi5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接

19、3 三、復制的終止三、復制的終止 岡崎片段的連接岡崎片段的連接哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期DNA合成期合成期G1G2SM第四節(jié)第四節(jié)真核生物真核生物DNA生物合成過程生物合成過程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes 真核生物每個染色體有多個起始點，是真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制多復制子復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步啟動。激活而不是同步啟動。一、真核生物復制的起始與原核生物基本相似一、真核生物復制的起始與原核生物基本相似 復制的起始需要復制的起始需要DNA-po

20、l（引物酶活性）（引物酶活性）和和DNA-pol（解螺旋酶活性）（解螺旋酶活性）參與。參與。 還需拓撲異構酶和復制因子還需拓撲異構酶和復制因子(RF)。 二、真核生物復制的延長發(fā)生二、真核生物復制的延長發(fā)生DNA聚合酶聚合酶/轉換轉換 前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生DNA聚合酶聚合酶 / 轉換的原因是轉換的原因是Pol 不具備不具備持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力。 DNA聚合酶聚合酶 / 轉換的轉換的關鍵蛋白是關鍵蛋白是RFC 。DNA聚合酶聚合酶 / 轉換轉換3553領頭鏈領頭鏈隨從鏈隨從鏈引物引物核小體

21、核小體三、真核生物三、真核生物DNADNA合成后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體5353親代親代DNA真核生物真核生物DNA復制與核小體組裝同步復制與核小體組裝同步進行，復制完成后隨即組裝成染色體進行，復制完成后隨即組裝成染色體3535355353535353真核生物真核生物DNADNA復制完成后，子鏈末端留下復制完成后，子鏈末端留下空隙空隙，母鏈成單鏈，母鏈成單鏈四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題 1、端粒、端粒(telomere)指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。分子末端的結構。功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的

22、穩(wěn)定性 維持維持DNA復制的完整性復制的完整性結構特點結構特點 由富含由富含TG的重復序列組成的重復序列組成; 人的端粒重復序列為人的端粒重復序列為5-(TnGn)x-3。TTTTGGGGTTTTGGGG2 2、端粒酶、端粒酶(telomerase) 特點：特點： 1. 由由RNA和蛋白質(zhì)構成的復合物和蛋白質(zhì)構成的復合物 2. 為特殊的逆轉錄酶，能以自身的為特殊的逆轉錄酶，能以自身的RNA為為 模板逆轉錄合成端粒模板逆轉錄合成端粒DNA 功能：功能： 合成端粒合成端粒DNA，維持端粒的長度，維持端粒的長度5 端粒酶端粒酶ACUAAACCCA AAACAAACCGAC35端粒酶的端粒酶的RNAA

23、CUAAACCCA AAACAAACCGAC353GTTTTGGGTTTTGG3OH端粒端粒DNA末端末端TGGTTTG3OH1 1、端粒酶靠、端粒酶靠AnCnAnCn與母鏈與母鏈DNADNA端粒結合端粒結合內(nèi)在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA為模版，逆轉錄，延長為模版，逆轉錄，延長DNADNA母鏈母鏈3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延長母鏈，同時模板，再次延長母鏈，同時DNADNA母鏈反摺利于下游復制延伸。母鏈反摺利于下游復制延伸。TGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGT

24、TTGGGGGGGGGTTTTGGTTTT4 4、延伸足夠長度后端粒酶脫離母鏈，代之以、延伸足夠長度后端粒酶脫離母鏈，代之以DNA-Pol DNA-Pol 。此時。此時母鏈母鏈3 3-OH-OH反折，同時作為引物和模板，完成末端雙鏈復制。反折，同時作為引物和模板，完成末端雙鏈復制。5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol端粒酶的催化延長作用端粒酶的催化延長作用 爬行模型爬行模型逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第五節(jié)第五節(jié) David BaltimoreRenato DulbeccoHowa