遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt

1、遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)1.1.果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作2.2.果蠅的伴性遺傳果蠅的伴性遺傳3.3.果蠅巨染色體的制片和觀察果蠅巨染色體的制片和觀察4.4.從口腔脫落細(xì)胞中提取人類基因組從口腔脫落細(xì)胞中提取人類基因組DNA DNA 5.PCR5.PCR法鑒定人法鑒定人SRYSRY基因基因6.6.學(xué)生自主創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)學(xué)生自主創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)微核檢測技術(shù)微核檢測技術(shù) 7.7.熒光定量熒光定量PCRPCR檢測煙草刺激后人肺細(xì)胞檢測煙草刺激后人肺細(xì)胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的表達(dá)變化基因的表達(dá)變化 8.8.人類人類ACEACE基因多態(tài)

2、檢測及其與耐力運(yùn)動能基因多態(tài)檢測及其與耐力運(yùn)動能力的關(guān)聯(lián)分析力的關(guān)聯(lián)分析注意安全！注意安全！v1.1.穿實(shí)驗(yàn)服。穿實(shí)驗(yàn)服。v2.2.各項(xiàng)操作務(wù)必規(guī)范，小心謹(jǐn)慎。對有各項(xiàng)操作務(wù)必規(guī)范，小心謹(jǐn)慎。對有毒有害物質(zhì)進(jìn)行操作時(shí)，要做好防護(hù)。毒有害物質(zhì)進(jìn)行操作時(shí)，要做好防護(hù)。v3.3.避免在實(shí)驗(yàn)室吃喝食物。避免在實(shí)驗(yàn)室吃喝食物。v4.4.遵守實(shí)驗(yàn)室其他安全守則。遵守實(shí)驗(yàn)室其他安全守則。實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式v實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)名稱 實(shí)驗(yàn)人員姓名實(shí)驗(yàn)人員姓名 學(xué)號學(xué)號 實(shí)驗(yàn)時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)間v一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膙二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理v三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟v四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一果蠅的培養(yǎng)、

3、形態(tài)觀察及整體裝片果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作的制作（一）果蠅的生活史（一）果蠅的生活史昆蟲綱，雙翅目。昆蟲綱，雙翅目。2525下，下，1212天完成一個周天完成一個周期期 ：卵：卵幼蟲幼蟲蛹蛹成蟲。成體果蠅可活成蟲。成體果蠅可活幾周。幾周。卵卵幼蟲幼蟲蛹蛹成蟲成蟲雌雄果蠅的主要雌雄果蠅的主要形態(tài)特征形態(tài)特征性狀性狀雌蠅雌蠅雄蠅雄蠅體型體型較大較大較小較小腹部末端腹部末端腹端尖腹端尖腹端鈍腹端鈍背部黑色橫紋背部黑色橫紋7條條(可見可見5條條)5條條(可見可見3條條)腹片數(shù)腹片數(shù)6片片4 片片性梳性梳無無有、位于前足附節(jié)上有、位于前足附節(jié)上（二）果蠅的培養(yǎng)及雜交（二）果蠅的培養(yǎng)及雜交 1

4、 1、果蠅培養(yǎng)時(shí)常用的培養(yǎng)基、果蠅培養(yǎng)時(shí)常用的培養(yǎng)基2 2、果蠅的麻醉、果蠅的麻醉 首先，將培養(yǎng)瓶棉塞上的果蠅驅(qū)到瓶底，打開首先，將培養(yǎng)瓶棉塞上的果蠅驅(qū)到瓶底，打開培養(yǎng)瓶與麻醉瓶的瓶塞，迅速使兩瓶口對接，培養(yǎng)瓶與麻醉瓶的瓶塞，迅速使兩瓶口對接，將培養(yǎng)瓶中部分果蠅驅(qū)入麻醉瓶中，迅速塞上將培養(yǎng)瓶中部分果蠅驅(qū)入麻醉瓶中，迅速塞上棉塞，防止果蠅的種群污染，拔開麻醉瓶棉塞，棉塞，防止果蠅的種群污染，拔開麻醉瓶棉塞，以其側(cè)面遮蓋麻醉瓶口，再棉塞中央滴幾滴乙以其側(cè)面遮蓋麻醉瓶口，再棉塞中央滴幾滴乙醚，塞上棉塞，等果蠅麻醉。（果蠅翅膀外層醚，塞上棉塞，等果蠅麻醉。（果蠅翅膀外層4545度角表死亡）度角表死亡）

5、3 3、果蠅的轉(zhuǎn)接、果蠅的轉(zhuǎn)接被麻醉果蠅移入飼養(yǎng)瓶中，將瓶橫臥置放，被麻醉果蠅移入飼養(yǎng)瓶中，將瓶橫臥置放，否則未醒果蠅粘著于飼料會溺死。待果蠅蘇否則未醒果蠅粘著于飼料會溺死。待果蠅蘇醒后再將瓶直立，貼上標(biāo)簽，放入培養(yǎng)箱。醒后再將瓶直立，貼上標(biāo)簽，放入培養(yǎng)箱。、處女果蠅的選取、處女果蠅的選取 雌果蠅受精囊內(nèi)可貯存大量的精子，因此雌果蠅受精囊內(nèi)可貯存大量的精子，因此在做品系間雜交時(shí)，母本必須選用處女蠅。在做品系間雜交時(shí)，母本必須選用處女蠅。雌蠅孵出雌蠅孵出12小時(shí)后才會交配（小時(shí)后才會交配（8小時(shí)更為可小時(shí)更為可靠），所以將老果蠅清除后，靠），所以將老果蠅清除后，12小時(shí)內(nèi)所小時(shí)內(nèi)所收集到的雌蠅就

6、是處女蠅。收集到的雌蠅就是處女蠅。（三）果蠅整體裝片的制作（三）果蠅整體裝片的制作、制片：取輕度麻醉的雌雄果蠅各一只放在、制片：取輕度麻醉的雌雄果蠅各一只放在載玻片上，待果蠅將醒能動時(shí)，滴一滴樹膠載玻片上，待果蠅將醒能動時(shí)，滴一滴樹膠在果蠅上，蓋上蓋玻片，讓蓋片自然沉降，在果蠅上，蓋上蓋玻片，讓蓋片自然沉降，要防止氣泡產(chǎn)生。滴樹膠的量以浸沒果蠅，要防止氣泡產(chǎn)生。滴樹膠的量以浸沒果蠅，蓋上蓋片不外漏為度。蓋上蓋片不外漏為度。、觀察：果蠅的背部橫紋、雄果蠅的性梳。、觀察：果蠅的背部橫紋、雄果蠅的性梳。（四）作業(yè)（四）作業(yè)制作一張良好的裝片，要求能夠看到果蠅的背制作一張良好的裝片，要求能夠看到果蠅的

7、背部橫紋及性梳。部橫紋及性梳。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二果蠅的伴性遺傳實(shí)驗(yàn)果蠅的伴性遺傳實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?v了解伴性遺傳和非伴性遺傳的區(qū)別，了解伴了解伴性遺傳和非伴性遺傳的區(qū)別，了解伴性遺傳基因在正、反雜交中的差異。性遺傳基因在正、反雜交中的差異。v掌握基本的遺傳結(jié)果記錄及統(tǒng)計(jì)處理方法。掌握基本的遺傳結(jié)果記錄及統(tǒng)計(jì)處理方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟1、雜交組合親本設(shè)計(jì)、雜交組合親本設(shè)計(jì)正交：紅眼雌蠅正交：紅眼雌蠅(處女蠅處女蠅)白眼雄蠅白眼雄蠅反交：白眼雌蠅反交：白眼雌蠅(處女蠅處女蠅)紅眼雄蠅紅眼雄蠅反交方法：反交方法： (a)把紅眼果蠅倒出麻醉，仔細(xì)挑出只雄蠅，移

8、到把紅眼果蠅倒出麻醉，仔細(xì)挑出只雄蠅，移到上述雜交瓶中，貼好標(biāo)簽。上述雜交瓶中，貼好標(biāo)簽。 (b) 把白眼雌蠅（處女蠅）倒出麻醉，挑只移到雜把白眼雌蠅（處女蠅）倒出麻醉，挑只移到雜交瓶中交瓶中。 (c)等雜交親本在雜交瓶中全部蘇醒后，將雜交瓶移等雜交親本在雜交瓶中全部蘇醒后，將雜交瓶移入入25溫箱中培養(yǎng)。溫箱中培養(yǎng)。2、第二周，倒去雜交親本果蠅。、第二周，倒去雜交親本果蠅。3、第三周，觀察、第三周，觀察F1眼睛顏色。將眼睛顏色。將F1全部倒全部倒出，輕度麻醉，觀察出，輕度麻醉，觀察F1成蠅，記載正反交成蠅，記載正反交結(jié)果結(jié)果 。觀察后，將。觀察后，將F1果蠅全部移入一新培果蠅全部移入一新培養(yǎng)瓶

9、（這里不需用處女蠅）置養(yǎng)瓶（這里不需用處女蠅）置25溫箱中溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)。4、第四周，倒去、第四周，倒去F1親本。親本。5、第五周，觀察、第五周，觀察F2成蠅眼睛顏色。被統(tǒng)計(jì)成蠅眼睛顏色。被統(tǒng)計(jì)過的果蠅處理掉。過的果蠅處理掉。四、實(shí)驗(yàn)記錄及結(jié)果分析四、實(shí)驗(yàn)記錄及結(jié)果分析X X2 2檢驗(yàn)（檢驗(yàn)（ F2F2） 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 果蠅巨染色體的制片與觀察果蠅巨染色體的制片與觀察一一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?、練習(xí)果蠅幼蟲的解剖技術(shù)及果蠅唾、練習(xí)果蠅幼蟲的解剖技術(shù)及果蠅唾腺染色體的制片方法腺染色體的制片方法2、觀察果蠅的唾腺染色體、觀察果蠅的唾腺染色體二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 唾腺染色體是一類存在于雙翅目昆蟲幼

10、蟲唾腺染色體是一類存在于雙翅目昆蟲幼蟲唾液腺內(nèi)的巨大染色體，由于染色體唾液腺內(nèi)的巨大染色體，由于染色體DNA經(jīng)過經(jīng)過多次復(fù)制，但并未發(fā)生細(xì)胞核分裂，重復(fù)復(fù)制多次復(fù)制，但并未發(fā)生細(xì)胞核分裂，重復(fù)復(fù)制后的染色線聚集在一起，因此比一般的染色體后的染色線聚集在一起，因此比一般的染色體大得多。同時(shí)，唾腺細(xì)胞中的同源染色體總是大得多。同時(shí)，唾腺細(xì)胞中的同源染色體總是處于配對狀態(tài)，因此在果蠅唾腺細(xì)胞只能看到處于配對狀態(tài)，因此在果蠅唾腺細(xì)胞只能看到體細(xì)胞染色體數(shù)目的一半。體細(xì)胞染色體數(shù)目的一半。 研究證明，多線染色體的帶紋與某些特定研究證明，多線染色體的帶紋與某些特定的基因相聯(lián)系，由于多線染色體上的帶紋清晰的

11、基因相聯(lián)系，由于多線染色體上的帶紋清晰可數(shù)，因此巨染色體是遺傳學(xué)上研究染色體形可數(shù)，因此巨染色體是遺傳學(xué)上研究染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體畸變的好材料。態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體畸變的好材料。三三 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1、取材、取材(三齡幼蟲，三齡幼蟲，5mm) 取一張載玻片放在雙筒解剖鏡下，滴一滴生理鹽水，取一張載玻片放在雙筒解剖鏡下，滴一滴生理鹽水，將幼蟲放在生理鹽水內(nèi)。兩手各握一枚解剖針，一將幼蟲放在生理鹽水內(nèi)。兩手各握一枚解剖針，一枚釘住幼蟲末端的枚釘住幼蟲末端的1/3處固定幼蟲，另一枚解剖針釘處固定幼蟲，另一枚解剖針釘住幼蟲頭部，前拉，把頭部自身體拉開，可看到唾住幼蟲頭部，前拉，把頭部自身體拉開，可看到

12、唾腺，剔除唾腺周圍的脂肪及其它物質(zhì)。腺，剔除唾腺周圍的脂肪及其它物質(zhì)。 2、固定染色、固定染色 吸去生理鹽水，滴數(shù)滴鹽酸，水解分鐘，吸去生理鹽水，滴數(shù)滴鹽酸，水解分鐘，使組織疏松，以便壓片時(shí)細(xì)胞分散，染色體使組織疏松，以便壓片時(shí)細(xì)胞分散，染色體散開。散開。 吸去鹽酸，加吸去鹽酸，加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干，滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干，滴滴12滴醋酸洋紅染液，固定染色滴醋酸洋紅染液，固定染色1020分分鐘。鐘。3.3.制片制片 染色完成后，蓋上蓋玻片壓片，然后用吸水染色完成后，蓋上蓋玻片壓片，然后用吸水紙包被玻片，吸干多余染色液，并用手指輕壓紙包被玻片，吸干多余染色液，并用手指輕壓蓋玻片，再用鉛筆的

13、橡皮頭或解剖針柄垂直輕蓋玻片，再用鉛筆的橡皮頭或解剖針柄垂直輕敲，或進(jìn)一步用拇指在蓋玻片上適當(dāng)用力壓片，敲，或進(jìn)一步用拇指在蓋玻片上適當(dāng)用力壓片，注意勿使蓋玻片移動。注意勿使蓋玻片移動。4.4.觀察觀察 將制片置低倍鏡下找到分散好的標(biāo)本，移至將制片置低倍鏡下找到分散好的標(biāo)本，移至視野中心，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體視野中心，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體分散、個體性清楚的片子，應(yīng)仔細(xì)觀察染色體分散、個體性清楚的片子，應(yīng)仔細(xì)觀察染色體的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序，以便對照模式的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序，以便對照模式照片辨認(rèn)出不同的染色體臂。照片辨認(rèn)出不同的染色體臂。 一般在一個唾腺細(xì)胞中能看到

14、一般在一個唾腺細(xì)胞中能看到5條長臂的染色體，分條長臂的染色體，分別為別為X染色體、第二對染色體的左臂（染色體、第二對染色體的左臂（L）、右臂）、右臂（R）、第三對染色體的左臂（）、第三對染色體的左臂（L）、右臂（）、右臂（R），），這這5條染色體臂由條染色體臂由染色中心染色中心發(fā)射出來。這是由于第發(fā)射出來。這是由于第四對染色體相當(dāng)小看不清，四對染色體相當(dāng)小看不清，Y染色體濃縮，染色體濃縮，X染色體染色體的著絲點(diǎn)位于端部只有一條臂之故。的著絲點(diǎn)位于端部只有一條臂之故。四四 作業(yè)作業(yè)v制作果蠅巨染色體裝片制作果蠅巨染色體裝片v畫出你所觀察到的果蠅巨染色體，并加畫出你所觀察到的果蠅巨染色體，并加以標(biāo)

15、注與描述。以標(biāo)注與描述。 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 從口腔脫落細(xì)胞中提取從口腔脫落細(xì)胞中提取人類基因組人類基因組DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解從細(xì)胞中提取、了解從細(xì)胞中提取DNA的基本原理的基本原理2、學(xué)習(xí)從口腔脫落細(xì)胞中提取高分子量、學(xué)習(xí)從口腔脫落細(xì)胞中提取高分子量DNA的基本操作步驟和會影響提取效果的注意事的基本操作步驟和會影響提取效果的注意事項(xiàng)。項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理DNADNA提取的方法：提取的方法：濃鹽法濃鹽法陰離子去污劑法陰離子去污劑法苯酚抽提法苯酚抽提法水抽提法水抽提法金屬螯合樹脂抽提法金屬螯合樹脂抽提法破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，釋放出破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，釋放出DNA。1.用蛋白酶用蛋白酶K（使膜上蛋白

16、（使膜上蛋白變性分解）和去污劑變性分解）和去污劑SDS（破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)）（破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)）共同消化細(xì)胞。共同消化細(xì)胞。2.然后酚、氯仿等有機(jī)溶劑然后酚、氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，進(jìn)行進(jìn)行抽提，進(jìn)行DNA的純化，的純化，去掉蛋白質(zhì)、去掉蛋白質(zhì)、RNA、多糖等、多糖等生物大分子。生物大分子。3.最后用無水乙醇沉淀最后用無水乙醇沉淀DNA，干燥后用干燥后用TE溶解，在溶解，在4下下可保存一年?？杀４嬉荒?。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1、先用清水漱口。然后用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙、先用清水漱口。然后用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將

17、唾液吐到杯中。用液吐到杯中。用1ml生理鹽水洗滌，后將生理鹽水洗滌，后將1.5ml液液體轉(zhuǎn)入體轉(zhuǎn)入1個干凈的個干凈的EP管中，管中，2000rpm離心離心5分鐘，分鐘，倒掉上清。倒掉上清。2、重復(fù)用、重復(fù)用1.0ml生理鹽水洗滌沉淀生理鹽水洗滌沉淀1次，離心，去上次，離心，去上清。清。3、沉淀中加、沉淀中加500l 1x細(xì)胞裂解液（細(xì)胞裂解液（STE），打散細(xì)胞），打散細(xì)胞團(tuán)、混勻，再加團(tuán)、混勻，再加15l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，充分混，充分混勻。勻。 55水浴水浴30min。4、加、加500l飽和飽和酚，輕搖混勻，室溫酚，輕搖混勻，室溫12000rpm離離心心10min。5、上清（注

18、意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及、上清（注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機(jī)相）移至另一加入裝有下層有機(jī)相）移至另一加入裝有500l氯仿的氯仿的EP管，輕搖混勻，室溫管，輕搖混勻，室溫12000rpm離心離心10min。6、吸取、吸取400l上清上清（注意不要吸到中間層白色絮狀（注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機(jī)相）至已裝有物質(zhì)以及下層有機(jī)相）至已裝有900 l預(yù)冷無水預(yù)冷無水乙醇的離心管，混合均勻，可見白色絮狀沉淀，乙醇的離心管，混合均勻，可見白色絮狀沉淀，10000rpm離心離心5min，DNA沉淀在管底。沉淀在管底。7 、 去 上 清 ， 加 入、 去 上 清 ， 加 入

19、7 0 % 乙 醇乙 醇 1 m l 清 洗 沉 淀 ，清 洗 沉 淀 ，10000rpm離心離心5min，去上清（盡量用小槍頭，去上清（盡量用小槍頭將液體去干凈，但注意不要將沉淀也吸走），將液體去干凈，但注意不要將沉淀也吸走），室溫干燥室溫干燥5min，再用，再用50l TE buffer溶解沉淀，溶解沉淀，4儲藏備用。儲藏備用。DNA純度和濃度鑒定純度和濃度鑒定紫外分光光度計(jì)測紫外分光光度計(jì)測OD值、瓊脂糖凝膠電泳檢測。值、瓊脂糖凝膠電泳檢測。1 OD260=0.05g/l DNA純品純品DNA： OD260/OD280=1.8 1.8 有有RNA 1.8 有蛋白有蛋白瓊脂糖凝膠電泳，可以

20、看到一條基因組瓊脂糖凝膠電泳，可以看到一條基因組DNA條帶。條帶。作業(yè)作業(yè)v提取人類口腔脫落細(xì)胞基因組提取人類口腔脫落細(xì)胞基因組DNA。實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 PCRPCR法鑒定人法鑒定人SRYSRY基因基因?qū)嶒?yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.1.認(rèn)識性別決定基因認(rèn)識性別決定基因SRYSRY，了解生物的性，了解生物的性別是由基因決定的。別是由基因決定的。2.2.了解了解PCRPCR方法鑒定基因的原理及步驟。方法鑒定基因的原理及步驟。42實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理SRYSRY基因在哺乳動物的性別分化過程中起著決基因在哺乳動物的性別分化過程中起著決定性的作用，該基因只存在于雄性個體中。以定性的作用，該基因只存在于雄性個體中。以人為研

21、究對象，對人為研究對象，對SRYSRY基因進(jìn)行基因進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增，若測擴(kuò)增，若測試者是男性，樣本中存在該基因，測試結(jié)果為試者是男性，樣本中存在該基因，測試結(jié)果為陽性；女性測試者則會相應(yīng)得到陰性結(jié)果。陽性；女性測試者則會相應(yīng)得到陰性結(jié)果。人人SRYSRY基因位于基因位于Yp11.3Yp11.3，只含有，只含有一個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)一個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約錄單位長約1.1kb1.1kb，編碼一個，編碼一個204204氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（一）獲取口腔脫落細(xì)胞，提?。ㄒ唬┇@取口腔脫落細(xì)胞，提取DNA（二）（二）PCR擴(kuò)增擴(kuò)增SRY基因基因（三）電泳檢

22、測（三）電泳檢測SRY基因基因 （SRY基因擴(kuò)增條帶大小約為基因擴(kuò)增條帶大小約為420bp。）。）PCRPCR反應(yīng)體系（共反應(yīng)體系（共25ul 25ul ） 10X10X緩沖液：緩沖液： 2.5ul2.5ul 引物：引物： 各各0.5ul0.5ul dNTP dNTP： 0.5ul0.5ul TapDNA TapDNA聚合酶：聚合酶： 0.5ul 0.5ul Mg Mg離子溶液：離子溶液： 1.5ul1.5ul 模板模板DNADNA： 2ul2ul ddH2O ddH2O： 17ul17ulvPCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)反應(yīng) （35個循環(huán)）個循環(huán)） 94 5min 94 30s 55 30s 72 30

23、s 72 5min作業(yè)作業(yè)vPCR擴(kuò)增擴(kuò)增SRY基因，觀察電泳結(jié)果是否與性基因，觀察電泳結(jié)果是否與性別相符合。別相符合。實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 微核檢測技術(shù)微核檢測技術(shù)（自主創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)）（自主創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解微核檢測技術(shù)原理和毒理遺傳學(xué)意義。2.培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力及解決各類問題的能力。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理微核（微核（micronucleusmicronucleus， 簡稱簡稱MCNMCN）也稱衛(wèi)星核，是細(xì)胞在分裂時(shí)因各種有害因素如輻也稱衛(wèi)星核，是細(xì)胞在分裂時(shí)因各種有害因素如輻射、化學(xué)藥劑的所帶來的損傷，使細(xì)胞核成份殘留射、化學(xué)藥劑的所帶來的損傷，使細(xì)胞核成份殘留在核外的微小核

24、染色質(zhì)塊，類似細(xì)胞核，游離于主在核外的微小核染色質(zhì)塊，類似細(xì)胞核，游離于主核之外，呈圓形或橢圓形，但體積較小，大小應(yīng)在核之外，呈圓形或橢圓形，但體積較小，大小應(yīng)在主核主核1/31/3以下。一般認(rèn)為以下。一般認(rèn)為 ，微核由染色體斷片和滯，微核由染色體斷片和滯留染色體組成。這些斷片或染色體在分裂過程中行留染色體組成。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核動滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)入到下一次分裂間期時(shí)，之外的核塊。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)入到下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。它們便濃縮成主核之外的小核，即形成

25、了微核。 通過微核檢測技術(shù)，可同時(shí)檢測染通過微核檢測技術(shù)，可同時(shí)檢測染色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不平衡、基因擴(kuò)增、不分離、平衡、基因擴(kuò)增、不分離、DNADNA損傷損傷修復(fù)障礙、修復(fù)障礙、HPRTHPRT基因突變、凋亡、細(xì)基因突變、凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳學(xué)終點(diǎn)，可胞分裂不平衡等多種遺傳學(xué)終點(diǎn)，可以用來評估某種環(huán)境因素是否具有誘以用來評估某種環(huán)境因素是否具有誘變性。變性。 蠶豆根尖微核檢測蠶豆根尖微核檢測泥鰍血紅細(xì)胞微核檢測泥鰍血紅細(xì)胞微核檢測三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟蠶豆根尖微核檢測蠶豆根尖微核檢測 蠶豆蠶豆:根尖細(xì)胞的染色體大，根尖細(xì)胞的染色體大，DN

26、A含量高，對誘含量高，對誘變因反應(yīng)敏感，便于觀察。變因反應(yīng)敏感，便于觀察。v蠶豆：實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)蠶豆：實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)處理（用選擇的誘變實(shí)驗(yàn)處理（用選擇的誘變劑處理劑處理2天）天）根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)固定固定酸解酸解染染色色結(jié)果觀察結(jié)果觀察用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩次，每次用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩次，每次3-5分鐘，吸分鐘，吸凈水，加入凈水，加入5mol/L鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解5-10分鐘，視幼根軟化程度而定，幼根軟化即可。分鐘，視幼根軟化程度而定，幼根軟化即可。吸去鹽酸，用水浸沒幼根三次，每次吸去鹽酸，用水浸沒幼根三次，每次12分鐘。最分鐘。最

27、后浸于水中。后浸于水中。制片時(shí)，將幼根放置于載玻片上，截下制片時(shí)，將幼根放置于載玻片上，截下12mm左左右長的根尖，滴一滴醋酸洋紅染液，染色右長的根尖，滴一滴醋酸洋紅染液，染色58分鐘。分鐘。蓋上蓋玻片，觀察。蓋上蓋玻片，觀察。圖圖1. 1. 蠶豆根尖細(xì)胞微核觀察圖（上方兩圖為染色體斷裂片段，下方兩圖為微核）蠶豆根尖細(xì)胞微核觀察圖（上方兩圖為染色體斷裂片段，下方兩圖為微核）泥鰍血紅細(xì)胞微核檢測泥鰍血紅細(xì)胞微核檢測v泥鰍：實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)泥鰍：實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)處理（用選擇實(shí)驗(yàn)處理（用選擇的誘變劑處理的誘變劑處理2天）天）制片制片染色染色結(jié)果觀察。結(jié)果觀察。用剪刀或刀片斷尾取泥鰍外周血于載玻片上，

28、用剪刀或刀片斷尾取泥鰍外周血于載玻片上，用一潔凈的載玻片迅速從一端向另一端刮去。用一潔凈的載玻片迅速從一端向另一端刮去。晾干后先用瑞氏染液染晾干后先用瑞氏染液染1min，然后用水洗去，然后用水洗去瑞氏染液，再用磷酸緩沖液稀釋瑞氏染液，再用磷酸緩沖液稀釋10倍后的姬倍后的姬母薩染液染母薩染液染 15 min ，水洗，晾干即可用顯，水洗，晾干即可用顯微鏡觀察。微鏡觀察。 a a 正常紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞 b b正常細(xì)胞核均等分裂正常細(xì)胞核均等分裂 c c正常細(xì)胞的均等分裂正常細(xì)胞的均等分裂 d d 核變形核變形 e e 核變形核變形 f f 核不均等縊縮核不均等縊縮泥鰍血紅細(xì)胞的血涂片圖泥鰍血紅細(xì)胞的

29、血涂片圖-1 泥鰍血紅細(xì)胞的血涂片圖泥鰍血紅細(xì)胞的血涂片圖-2 g g 微核微核 h h 微核微核 i i細(xì)胞不均等分裂細(xì)胞不均等分裂 j j 細(xì)胞不均等分裂細(xì)胞不均等分裂 k k 細(xì)胞開始凋亡細(xì)胞開始凋亡 l l細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解作業(yè)作業(yè)蠶豆：每一處理至少觀察蠶豆：每一處理至少觀察3個根尖，每個根尖數(shù)個根尖，每個根尖數(shù)1000個細(xì)胞，計(jì)算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。個細(xì)胞，計(jì)算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。泥鰍：每處理泥鰍：每處理3個重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)個重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)1000個細(xì)胞個細(xì)胞 ，計(jì)，計(jì)算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。微核率微核率= = 微核

30、細(xì)胞數(shù)觀察細(xì)胞總數(shù)微核細(xì)胞數(shù)觀察細(xì)胞總數(shù) 1000 1000 污染指數(shù)（污染指數(shù)（PIPI）= =樣品實(shí)測樣品實(shí)測MCNMCN平均值平均值/ /對照組對照組MCNMCN平平均值均值實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 熒光定量熒光定量PCRPCR檢測煙草刺激后人檢測煙草刺激后人肺細(xì)胞肺細(xì)胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的基因的表達(dá)變化表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解基因表達(dá)與環(huán)境的關(guān)系了解基因表達(dá)與環(huán)境的關(guān)系2.了解熒光定量了解熒光定量PCR技術(shù)的原理和基本步技術(shù)的原理和基本步驟驟3.研究吸煙刺激后肺細(xì)胞基因表達(dá)的變化研究吸煙刺激后肺細(xì)胞基因表達(dá)的變化實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：u 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)

31、熒光定量PCR是在是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)。它是在來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)。它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時(shí)反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。板濃度進(jìn)行定量分析。u ERCC4：在：在DNA損傷修復(fù)中的重要功能。損傷修復(fù)中的重要功能。 GAPDH：甘油醛：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，在不同條件下，磷酸脫氫酶，在不同條件下，GAPDH的表達(dá)相對穩(wěn)定，可作為內(nèi)參照。的表達(dá)相對穩(wěn)定，可作為內(nèi)參照。u 在本次實(shí)驗(yàn)中，我們

32、將利用實(shí)時(shí)熒光定量在本次實(shí)驗(yàn)中，我們將利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在吸煙刺激下，分析在吸煙刺激下，ERCC4基因的表達(dá)變化?；虻谋磉_(dá)變化。Threshold lineC(t) value 閾值閾值：熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn) C(t)C(t)值值：熒光信號到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。擴(kuò)增階段：擴(kuò)增階段： 指數(shù)期指數(shù)期 平臺期平臺期

33、兩種定量方法v絕對定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線法v相對定量 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 2 -c(t)-c(t) 法法實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：一、樣品準(zhǔn)備（已完成）一、樣品準(zhǔn)備（已完成）1、CSE（香煙煙霧提取物）的制備（香煙煙霧提取物）的制備2、HELF細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞）的培養(yǎng)細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞）的培養(yǎng)3、CSE處理處理HELF細(xì)胞細(xì)胞4、總、總RNA的抽提的抽提5、逆轉(zhuǎn)錄生成、逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA二、二、Realtime PCR反應(yīng)反應(yīng)1.Realtime PCR反應(yīng)體系配置：反應(yīng)體系配置：2 Syber green PCR MasterMix 10 l10uM 的的PCR特異引物特異引物10.5 l10uM 的的PCR特異引物特異引物20.5 l樣品樣品 1 lH2O 8ul 總體積為總體積為 20 l輕彈管底將溶液混合，輕彈管底將溶液混合，5000 rpm短暫離心。短暫離心。2.將上述將上述PCR反應(yīng)溶液置于反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)儀上進(jìn)行行PCR反應(yīng)。反應(yīng)。 GAPDH、 ERCC4 反應(yīng)溫度：反應(yīng)溫度： 95，5min；30個個PCR循環(huán)（循環(huán)（95，30秒；秒；55，30秒；秒；72，30秒；（收