細胞計數(shù)與細胞增

1、細胞計數(shù)與細胞增殖金潔一、培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察v體外培養(yǎng)的細胞主要有兩種狀態(tài)。一 種是能貼附在培養(yǎng)支持物上的細胞，如 HeLa 細胞、NH3T3等，叫貼壁型細胞，體外培養(yǎng)的細胞絕大多數(shù)都屬于這種細胞。另一種細胞并不貼附在容器的壁上，而是懸浮在培養(yǎng)液中生長，如 HL60，叫做懸浮型細胞，這類細胞主要是血液原性或癌原性的細胞。貼壁貼壁( (粘附粘附) )型細胞型細胞 粘附粘附: :是大多數(shù)有機體是大多數(shù)有機體細胞細胞在體內(nèi)在體內(nèi) 生存生存和和生長發(fā)育生長發(fā)育的的基本存在方式基本存在方式基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織， 有機體的絕大多數(shù)細

2、胞必須有機體的絕大多數(shù)細胞必須 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生長生長。培養(yǎng)時培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后, ,同樣需要粘附于某同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞屬于粘附型細胞。粘附粘附( (錨定或錨著錨定或錨著) )依賴型依賴型( (性性) )細胞：唯有粘附于固相表面才能細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞生存的細胞 類型類型 細胞在體內(nèi)、外細胞在體內(nèi)、外的的粘附粘附方式：方式：存在差異存在差異 體內(nèi)體內(nèi)：粘附粘附是是全方位全方位 外形外形具有具有復雜的立體特征復雜的立體特

3、征 體外體外：多數(shù)情況，細胞只有：多數(shù)情況，細胞只有一個附著平面一個附著平面 外形外形一般一般與體內(nèi)時明顯不同與體內(nèi)時明顯不同 按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型幾大類型 分類分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類：類： 上皮樣上皮樣 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 其它，不定型其它，不定型上皮樣細胞型上皮樣細胞型 名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于，實際上不完全等于-來源：來源：來源于外胚層來源于外胚層，內(nèi)胚層細胞，內(nèi)胚層細胞 如：皮膚及其衍生物如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤上皮性腫

4、瘤形態(tài)：形態(tài)：類似類似體內(nèi)的體內(nèi)的上皮細胞上皮細胞 扁平扁平，不規(guī)則多角形不規(guī)則多角形，中有圓形核，中有圓形核 生長特點生長特點 易相連易相連成片成片 相靠相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀鋪石狀 生長生長時呈時呈膜狀膜狀移動移動 很少很少脫離細胞群而脫離細胞群而單個活動單個活動 成纖維細胞樣細胞成纖維細胞樣細胞 名稱：名稱：凡在凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的的來源：來源：由由中胚層間充質(zhì)組織起源中胚層間充質(zhì)組織起源的組織的組織 如：真正的成纖維細胞如：真正的成纖維細胞 心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞

5、似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)的形態(tài) 胞體梭形胞體梭形或不規(guī)則三角形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出胞質(zhì)向外伸出23個個長短不等的突起長短不等的突起 中有卵圓形核中有卵圓形核生長特點生長特點 排列成排列成放射狀放射狀，漩渦狀，漩渦狀 并不緊靠連成片并不緊靠連成片， 細胞細胞細胞接觸易斷開而細胞接觸易斷開而 單獨行動單獨行動 游離的游離的單獨的單獨的成纖維樣細胞，成纖維樣細胞， 常有幾個常有幾個伸長的細胞突起伸長的細胞突起 培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿太酸或太堿 標準標準pH 成

6、纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞 細胞密度細胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞 生長狀態(tài)改變生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附懸浮或貼附 懸浮懸浮 貼附貼附 圓形圓形 成纖維或上皮樣成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化后 成纖維樣成纖維樣 可成上皮樣可成上皮樣 懸浮生長型懸浮生長型概念概念 培養(yǎng)時培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源來源自自血血，脾或骨髓，脾或骨髓， 尤以血中白細胞尤以血中白細胞 癌腫細胞也可能癌腫細胞也

7、可能特點特點 在在懸浮中生長良好懸浮中生長良好 細胞細胞圓形圓形，單個或小細胞團，單個或小細胞團優(yōu)點優(yōu)點 生存空間大，生存空間大，提供數(shù)量大提供數(shù)量大 傳代方便傳代方便(不需消化不需消化) 易于收獲易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點缺點 觀察不方便觀察不方便 很多細胞不能懸浮生長很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞尤以正常細胞) 細胞形態(tài)觀察細胞形態(tài)觀察v貼壁細胞在生長狀態(tài)良好時，細胞內(nèi)顆粒少，看不到有空泡，細胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮的細胞和碎片，培養(yǎng)液清澈透明，而當細胞內(nèi)顆粒較多，透明差，空泡多時，表明生長較差。當瓶內(nèi)培養(yǎng)基混濁時，應想到細菌真菌污染的可能。懸浮細胞當邊緣清楚，透

8、明發(fā)亮時，生長較好；反之，則較差或已死亡。由于培養(yǎng)基內(nèi)有 pH 指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細胞的生長狀態(tài)。呈橙黃色時，細胞一般生長狀態(tài)較好；呈淡黃色時，則可能是培養(yǎng)時問過長，營養(yǎng)不足，死亡細胞過多；如呈紫紅色，則可能是細胞生長狀態(tài)不好，或已死亡。 細胞污染細胞污染v細菌污染細菌污染v真菌污染真菌污染v細菌和真菌的清除細菌和真菌的清除v支原體污染支原體污染v支原體的清除支原體的清除細菌污染細菌污染 v細胞培養(yǎng)常見的污染v最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 v培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。v污

9、染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。 真菌污染真菌污染v真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。 ! 細菌和真菌的清除細菌和真菌的清除 使用抗生素v抗生素對殺滅細菌較有效。（當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平）。v聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。v預防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 v污染后清除用藥需采用大于常用量510倍藥物沖洗法，于加藥后作用2448小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。959

10、5以上是以下四種支原體：以上是以下四種支原體：口腔支原體（口腔支原體（M.oraleM.orale）精氨酸支原體（精氨酸支原體（M.argininiM.arginini）豬鼻支原體（豬鼻支原體（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性問題，平均發(fā)生率達到世界性問題，平均發(fā)生率達到11%11%能改變細胞的能改變細胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表達及蛋白表達不能通過可視法對其進行檢測不能通過可視法對其進行檢測對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污

11、染來源：來源：操作環(huán)境不良操作環(huán)境不良操作人員的疏失操作人員的疏失實驗器具不潔等實驗器具不潔等已受污染的細胞已受污染的細胞已受污染的培養(yǎng)基、血清已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染支原體污染熒光染色法熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(PCR)法法支原體污染檢測支原體污染檢測細胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃細胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細胞生長變緩，部分細胞發(fā)細胞生長變緩，部分細胞發(fā)生脫落等等，細胞間隙可見鋪滿細沙樣小點。生脫落等等，細胞間隙可見鋪滿細沙樣小點。支原體污染表現(xiàn)支原體污染表現(xiàn)熒光染色法(33258)顯示染色體，細胞周

12、圍亮點為支原體掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體 支原體的清除支原體的清除 支原體清除劑支原體清除劑MRA （Mycoplasma Removal Agent）處理法）處理法每每4天換一次液，連續(xù)處理天換一次液，連續(xù)處理15天天清洗純化法清洗純化法v細胞營養(yǎng)馴化細胞營養(yǎng)馴化優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選細胞清洗細胞清洗反復離心洗滌反復離心洗滌 v原理：由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生，所以通原理：由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生，所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)

13、量降低至極限. v如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。v對支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。 藥物輔助高溫處理法藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41培養(yǎng)培養(yǎng)18小時，可殺小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。死支原體，但對細胞有不良影響。支原體特異性血清法支原體特異性血清法 用用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原的兔支原體

14、免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。個月后仍為陰性。 二、培養(yǎng)細胞的計數(shù)及活細胞的鑒定v在細胞生物學的實驗中，往往要進行活細胞的鑒定和細胞的計數(shù)、調(diào)整細胞的密度，是進行實驗必不可少的一種基本技能。1細胞計數(shù)細胞計數(shù)v將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。v將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。v靜置3分鐘。v鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：v 細胞數(shù)/ml（4大格細胞總數(shù)/ 4）10000v注意

15、：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。2細胞活力細胞活力將細胞懸液以0.5ml加入試管中。加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。另外，活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。細胞計數(shù)時的注意事項細胞計數(shù)時的注意事項消化單層細胞時，務求細胞分散良好，制成單個細胞懸液。否則會影響細胞計數(shù)結果。取樣計數(shù)前，應充

16、分混勻細胞懸液。在連續(xù)取樣計數(shù)時尤應注意這一點。否則，前后計數(shù)結果會有很大誤差。鏡下計數(shù)時，遇見2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計數(shù)。如細胞團占10%以上，說明消化不充分。細胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細胞懸液時，加液量不要溢出蓋片，也不要過少或帶氣泡。在計數(shù)過程中，對大方格的邊緣壓線細胞應按數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進行計數(shù)。染色標本在計數(shù)細胞時必須在15分鐘內(nèi)檢查計數(shù)完畢。因為臺盼藍染液可以將死細胞迅速地染上藍色，再延長時間則活細胞也將逐漸著色。細胞增殖實驗（細胞增殖實驗（MTT法）法）v(

17、一)原理vMTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑藍）為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium四唑環(huán)開裂，生成藍色的結晶，結晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的結晶可以用DMSO來溶解，利用酶標儀測定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數(shù)目。v(二)操作（實用于貼壁細胞）v1.接種細胞：用含10胎小牛血清

18、得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔100010000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul. 2.:培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-3天（可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。 3.顯色：分別培養(yǎng)不同時間，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。 4.比色：選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。v(三)結果v以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線或

19、計算細胞生長抑制率、細胞相對增殖率等。v【注意事項】v1.選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。邊緣孔用無菌PBS填充。2.避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在顯色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3.設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。每組設定3復孔。4.MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。 5.酶聯(lián)免疫檢測儀使用前應打開電源預熱半小時。v6.選擇不

20、同的波長，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測靈敏度不同。應根據(jù)實驗目的選擇相應的波長。v7.懸浮細胞先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘?；蛴胏ck-8。CCK-8方法vCCK-8是一種基于WST-8的檢測細胞增殖和細胞毒性的方法。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，細胞越少，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。通常96孔板每孔加入10%培養(yǎng)基體積的CCK-8，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4個小時，時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情

21、況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，檢測波長為450nm。 應用舉例v1. MTT實驗實驗v6孔板接種HCCLM3細胞，1*106每孔，后取1*107病毒每孔加入（LASS2與GFP對照），感染90分鐘后，再加入1ml的培養(yǎng)液，24h后，細胞用胰酶消化成細胞懸液，細胞調(diào)密度至1000每孔接種96孔平底板，每孔100 ul（邊緣孔用無菌PBS填充）。 5%CO2，37孵育24h后，每孔加入20ulMTT（噻唑蘭）溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，37孵育15min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490

22、nm處測量各孔的吸光值。細胞分為3組：LASS2組，GFP組和不加病毒對照組，每組3個復孔，同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。連續(xù)檢測6天，OD值繪生長曲線。v結果：LASS2腺病毒感染HCCLM3細胞后，能抑制細胞的生長。采用Students t-test進行統(tǒng)計學分析，差異有顯著性（p0.05）。培養(yǎng)液pH 值變化太快vCO2 張力不對，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊，NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足，培養(yǎng)液中鹽濃度不正確，細菌、酵母或真菌污染v（1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對應CO2 濃度為5 到10。v（

23、2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。v松開瓶蓋1/4 圈。v加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。v丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變v用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來，冰凍保存培養(yǎng)液v用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌。v將培養(yǎng)液加熱到37，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時pH 發(fā)生變化v細菌或真菌污染v丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。培養(yǎng)細胞不貼壁v胰蛋白酶消化過度，支原體污染，培養(yǎng)液中無貼壁因子v縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。v分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。培養(yǎng)細胞生長減慢v由于更換不同培養(yǎng)液或血清，培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分，如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染，試劑保存不當。接種細胞起始濃度太低，細胞已老化，支原體污染。v比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。v增加起始培養(yǎng)細胞濃度。v讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液。v換入新鮮配制培養(yǎng)液。v補加谷氨酰胺或生長因子。v用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。v血清需保存在-5 到-20。培養(yǎng)液需在28避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8保存，并在2 周內(nèi)用完。v增加接種細胞起始濃度，換用新的保種細胞。v分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支