醫(yī)學(xué)標書例文

1、河南省科技攻關(guān)計劃項目申 請 書姓 名： Luo Binjie 項目名稱： miRNA與膀胱癌診斷，臨床治療的相關(guān)研究 單 位： 鄭州大學(xué) 聯(lián)系電話： 填 報 說 明 請根據(jù)自己的專業(yè)及研究方向，針對某具體臨床問題，結(jié)合所學(xué)習(xí)臨床科研方法的一種或幾種寫出一份科研設(shè)計。完成后，文件以個人姓名命名，發(fā)至：。考核成績依設(shè)計書優(yōu)略評定。截至日期2013年11月8日。一、項目的立項依據(jù)和意義（說明國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展水平和趨勢等）全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌發(fā)病率為7.49/10萬，世界人口標化發(fā)病率（世標率）為4.53/10萬，膀胱癌居中國男性泌尿生殖系惡性腫瘤發(fā)病率第1位, 居中國惡性腫瘤發(fā)病率第8位，

2、居中國男性惡性腫瘤發(fā)病率第6位 ，全國腫瘤登記人口膀胱癌發(fā)病率,呈現(xiàn)逐年增長趨勢1。孫思邈千金要方卷一診候：“古之善為醫(yī)者，上醫(yī)醫(yī)未病之病，中醫(yī)醫(yī)欲病之病，下醫(yī)醫(yī)已病之病。在醫(yī)學(xué)如此高速發(fā)展的今天，我們顯然不會滿足大多數(shù)“發(fā)現(xiàn)無痛性肉眼血尿-進行膀胱鏡檢-再行手術(shù)切除膀胱灌注”的這一套最常見的膀胱癌診治流程。介入科韓新巍教授說過未來醫(yī)學(xué)是微創(chuàng)和介入醫(yī)學(xué)的為主導(dǎo)的，內(nèi)外科為輔助的醫(yī)學(xué)。顯然對miRNA的探求能對膀胱癌的診治帶來前所未有的契機。微小核糖核酸（microRNA ，miRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行調(diào)控。miRNA 在膀胱癌的演進過程中發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的作用。目前研究

3、表明，對miRNA 的調(diào)控可為臨床膀胱癌的診治提供一個新的靶點，提高膀胱癌患者的遠期生存率和生活質(zhì)量2。1：關(guān)于miRNA: miRNAs 是一類大小為19個25個堿基的單小分子RNA。在細胞核內(nèi)，它本身不編碼蛋白，但是可調(diào)節(jié)其他基因的翻譯表達。miRNA 初級產(chǎn)物在RNA 聚合酶 作用下合成miRNA 轉(zhuǎn)錄前體（PrimiRNA） ，然后經(jīng)RNA 聚合酶 （Drosha 酶）和DGCR 蛋白加工后，形成發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體（Precursor miRNA ，premiRNA），最終被轉(zhuǎn)運體Exportin 轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，由核酸酶Dicer 剪切形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAin

4、duced silencing complex ，RISC）。miRNA 通過與靶mRNA 特異堿基配對而引起靶miRNA 的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖和凋亡 。細胞可分泌含miRNA 的復(fù)合物進入體液，如尿液、血液、唾液、母乳 。一種miRNA可靶向一個或者多個mRNA ，多種miRNA 也可同時靶向一個mRNA。因此，異常表達的miRNA 不僅能致癌而且有腫瘤抑制的功能。2：miRNA與膀胱癌的關(guān)系的研究趨勢及范圍表1：部分膀胱癌相關(guān)miRNAs 的差異表達（數(shù)據(jù)來源于miRNAs 在膀胱癌診治中的研究進展）miRNA miRNA 表達變化 推測靶基因

5、 miRNA-a 上調(diào) PTEN miRNA- 上調(diào) miRNAa 下調(diào) FOXA miRNA 下調(diào) IncRNA UCA miRNA 下調(diào) FOXM miRNA 下調(diào) PAK miRNA 下調(diào) miRNA 下調(diào) ADAM miRNAb 下調(diào) SIRT，MALAT 表2：miRNA表達水平變化與膀胱尿路上皮癌的關(guān)系3表3：miRNA家族的一些機制細分3.國內(nèi)外相關(guān)研究成果 I：miRNA與膀胱癌早期診斷的一些研究發(fā)現(xiàn)Tolle 等在血液中和尿液中不同表達的miRNAs 來發(fā)現(xiàn)膀胱癌，采用數(shù)據(jù)庫來源于the Sanger database v 的基因芯片分析，在血液中，miRNAbp 、miRN

6、Ap 、miRNAp 在浸潤性膀胱癌中高表達，而且miRNAbp 特異度為 ，敏感度為 。在尿液中miRNA 、miRNAbp 在浸潤性膀胱癌中高表達，而且miRNAbp 特異度為 ，敏感度為 。由此推斷，根據(jù)血液、尿液中一些特異的miRNAs 來診斷浸潤性膀胱癌成為一種可能4。Zhang等檢測 例膀胱癌患者手術(shù)標本的癌組織和鄰近正常組織miRNA 表達水平，分析它們與臨床病理參數(shù)和預(yù)后評估相關(guān)性。結(jié)果顯示腫瘤組織miRNA 的表達水平顯著高于相應(yīng)的非癌組織（ P ） 。KaplanMeier 分析表明，具有較高miR表達水平的患者與低表達水平患者相比較， 年生存率分別為 和 。其中包括miR

7、NA 過表達，腫瘤病理分級，腫瘤分期和腫瘤數(shù)目的多變量Cox 回歸分析，miRNA 的過表達與較差存活率獨立相關(guān)（HR ， CI ： ，P ） 。miRNA 的過表達提示膀胱癌預(yù)后不良，并且可以被用來作為警示預(yù)后不良的生物標志物5。Feng 等利用Taqman 探針莖 環(huán)法PCR 精確測量 對患者的膀胱癌組織、相鄰的非腫瘤組織、膀胱癌患者和正常人對照的血漿miRNAa 水平。用miRNAa 模擬和抑制劑轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNAa 在膀胱癌組織中顯著上調(diào)，而且miRNAa 的表達水平與癌細胞的侵襲能力相對應(yīng)。同時，獲得或丟失miRNAa 的功能性試驗印證了它可能在膀胱癌的發(fā)展中起癌基因

8、作用。此外，膀胱癌患者的血漿中檢出的miRNAa 支持發(fā)展為膀胱癌的潛在診斷標記物。另一組研究者利用互補的反義核酸轉(zhuǎn)染到原先上調(diào)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)其表達明顯受到抑制，并檢測出腫瘤細胞增殖明顯減緩6。 Zhu 等通過小干擾RNA（siRNA）和miRNA 介導(dǎo)的IGFIR 的敲除實驗揭示了miRNA 促進癌細胞凋亡，進一步分析發(fā)現(xiàn)主要通過影響的IGFIR 信號傳導(dǎo)，以抑制IGFIR 的表達，抑制癌細胞增殖和遷移，起到抑癌基因的作用。另一組研究者發(fā)現(xiàn)膀胱癌中miRNAa 、miRNA 、miRNA 、miRNA 均體現(xiàn)為抑癌基因的作用。他們采用轉(zhuǎn)染的方式上調(diào)其表達，發(fā)現(xiàn)癌細胞增殖、分化能力明顯受

9、抑制，而且侵襲、遷移能力也減弱，印證了它抑癌基因作用的推測7.（檢測出來了說明對于膀胱癌患者是好的） II:miRNA與膀胱癌的治療 Li 等研究發(fā)現(xiàn)，以順鉑為基礎(chǔ)的化療誘導(dǎo)了miRNAa 的啟動子去甲基化，增加miRNAa 的表達，反過來增強了肌層侵入性膀胱癌細胞對順鉑的敏感性，降低了癌細胞侵襲性和增殖能力8。Kozinn 等根據(jù)miRNAs 的變化來預(yù)測是否對吉西他濱有抵抗性，研究結(jié)果提示miRNA 、miRNA 、miRNAleti 、miRNAletb 通過調(diào)節(jié)黏蛋白 ，使吉西他濱產(chǎn)生耐藥性。由此設(shè)想，通過調(diào)控的特定miRNAs 的表達或者影響其上游基因信息傳遞通路，可以增強膀胱癌化療

10、的敏感性以及減少其耐藥性9。把表達p 基因的腺病毒載體和靶向于CDKNA基因的人工miRNA 轉(zhuǎn)染進入癌細胞可增加癌細胞對阿霉素的化療敏感性；miRNA 的表達增加可通過靶向DNA 修復(fù)酶位點增強腫瘤細胞在輻射中的敏感性10.為解決臨床膀胱癌患者對順鉑耐藥的問題，Drayton等研究發(fā)現(xiàn)SLCA 基因的表達與miRNAa的表達呈負相關(guān)，當miRNAa 高表達或者通過siRNA、柳氮磺胺吡啶降低SLCA 基因的活性時，耐藥的膀胱癌細胞株的致敏性得以恢復(fù)，由此可推測miRNAa 可作為治療膀胱癌患者對順鉑耐藥的一條途徑11。4：選取自己感興趣的mi-RNA家族成員進行研究相關(guān)研究表明mi-RNA9

11、9a作為一個腫瘤抑制因子，在膀胱癌中水平降低，有降低尿路上皮癌侵襲性可能。其他相關(guān)研究：mi-RNA在人類可以通過靶基因mTOR促進食管鱗狀細胞的凋亡12 ，mi-RNA的低表達也能促進口腔鱗癌細胞的增殖13。那么它的高表達是否意味著膀胱癌患者癌細胞同樣受到抑制，提示著患者預(yù)后較好？或者依據(jù)miRNAs 表達的時序性和組織特異性特征，可以探索膀胱癌各個發(fā)展階段中的特定miRNA 表達譜，用于判斷膀胱癌惡性程度和臨床分期？或者是提前通過測量其相關(guān)調(diào)控基因產(chǎn)物預(yù)測患者患膀胱腫瘤風險？或者是了解它的表達是否能增強治療膀胱腫瘤藥物的敏感性及耐藥性等？我選取一個比較小的研究點：研究可以反其道而行之，根據(jù)

12、臨床上已經(jīng)確診的膀胱癌的標本或者細胞株來測量mi-RNA的含量，同時測量一定標本正常人群mi-RNA的含量，來推測膀胱尿路上皮癌各個發(fā)展階段中的特定miRNA 表達譜是否與膀胱癌惡性程度和臨床分期存在著某些統(tǒng)計學(xué)上的聯(lián)系。1：韓蘇軍, 張思維，陳萬青，李長嶺。中國膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢分析。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，泌尿外科。2：梁敏，王海峰，王劍松。miRNAs 在膀胱癌診治中的研究進展。醫(yī)學(xué)與哲學(xué)2015 年6月第36卷第6B 期總第527期。3孫陽綜述,郭劍明審校.miRNA調(diào)控與膀胱癌的關(guān)系研究進展。International Journal of Urology and N

13、ephmlogy。Jan 201 1V0131 NOI4Tolle A ，Jung M ，Rabenhorst S ，et al Identification of microRNAs in blood and urine as tumour markers for the detection of urinary bladder cancerJ Oncol Rep ，2013 ，30（4） ：1949 1956 5Zhang D Q ，Zhou C K ，Jiang X W ，et al Increased expression of miRNA222 is associated with

14、poor prognosis in bladder cancer J World J Surg Oncol ，2014 ，12 ：241 6張明，魏巍，劉祿成，等反義微小RNA21對人膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響J 吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010 ，36（3）：450 452 7張超，姚志勇，朱鳴陽，等microRNA34a 通過Notch 對膀胱腫瘤細胞株T24 增殖的影響J解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012 ，37（5） ：426 430 8Li H ，Yu G ，Shi R ，et al Cisplatininduced epigenetic activation of miR34 a sensit

15、izes bladder cancer cells to chemotherapy J Mol Cancer ，2014 ，13（1） ：8 9Kozinn S I ，Harty N J ，Delong J M ，et al MicroRNA Profile to Predict Gemictabine Resistance in Bladder Carcinoma Cell Line J Genes Cancer ，2013 ，4（1 /2） ：61 -69 10Josson S ，Sung S Y ，Lao K ，et al Radiation modulation of microRNA

16、 in prostate cancer cell linesJ Prostate ，2008 ，68（15） ：1599 1606 11Drayton R M ，Dudziec E ，Peter S ，et al Reduced Expression of miRNA27 a Modulates Cisplatin Resistance in Bladder Cancer by Targeting the CystineGlutamate Exchanger SLCAJ Clin Cancer Res ，2014 ，20（7） ：1900 200012Sun J, Chen Z, Tan X,

17、 Zhou F, Tan F, Gao Y, Sun N, Xu X, Shao K, He J:MicroRNA-99a/100 promotes apoptosis by targeting mTOR in human esophageal squamous cell carcinoma. Med Oncol 2013, 30:411.13Yan B, Fu Q, Lai L, Tao X, Fei Y, Shen J, Chen Z, Wang Q: Downregulation of microRNA 99a in oral squamous cell carcinomas contr

18、ibutes to the growth and survival of oral cancer cells. Mol Med Rep 2012, 6:675681.二、項目創(chuàng)新點、主要研究開發(fā)內(nèi)容及目標（實施方案、技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)路線和技術(shù)經(jīng)濟指標等）實施方案：通過實驗測量膀胱癌標本不同臨床分期，病理分期mi-RNA含量，同時測量一定標本正常人群mi-RNA的含量，來推測膀胱尿路上皮癌各個發(fā)展階段中的特定miRNA 表達譜是否與膀胱癌惡性程度和臨床分期存在著某些統(tǒng)計學(xué)上的聯(lián)系。1：技術(shù)經(jīng)濟指標哺乳動物血清中循環(huán)核酸表達水平穩(wěn)定，檢測的可重復(fù)性良好，具有作為腫瘤標志物的潛力1。尿液、糞便甚至毛發(fā)

19、，也是臨床上易于獲得的檢測樣本。如果能找到相應(yīng)的miRNAs 表達譜，又具有較高的敏感性和特異性，來作為膀胱癌診斷的生物標記物，替代目前的有創(chuàng)性檢查，將是巨大的突破。最終我們希望通過大量實驗證實：可以依據(jù)miRNAs 表達的時序性和組織特異性特征，探索膀胱癌各個發(fā)展階段中的特定miRNA 表達譜，用于判斷膀胱癌惡性程度和臨床分期，從而為診治提供依據(jù)。2：技術(shù)路線 i：選取實驗對象：選取我院住院患者中40例（便于統(tǒng)計學(xué)檢驗）正常膀胱粘膜上皮組織（可取材于成人尿道下裂手術(shù)），選取50例已經(jīng)確診為膀胱癌患者的手術(shù)標本（可非浸潤性I,II,III級各10例，浸潤性標本20例，需由病理科配合完成）。溝通

20、患者簽署研究知情同意書，研究方案交醫(yī)院倫理委員會批準。ii：組織總RNA的提取及質(zhì)量檢測：從上述組織標本中取50 100 mg組織塊以提取總RNA，組織塊在液氮中研磨成粉末狀后倒入勻漿器中，加1 ml TRIzol （TRIZOL是一種新型總RNA抽提試劑）處理，然后倒入Ep 管中，12 000 r /min，4離心20 min 后取上清，按照Invitrogen 公司的TRIzol 使用說明書提取總RNA。甲醛變性膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量.iii：逆轉(zhuǎn)錄cDNA 合成，定量PCR: 采用50 l 反應(yīng)體系:5 l 模板( 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，4 l 引物混合物(10 pmol /l)，25 l 2

21、 SYBR Green，16 l 水。反應(yīng)條件:95 15 min;95 15 s，56 20 s，68 20 s，擴增40個循環(huán);95 1 min，56 1 min，95 1 min，采集熔解曲線.iv：實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTqPCR)檢測miRNA-99a的相對表達量vi：基因表達水平計算：以 CT （ CT 標本目的基因CT 值標本內(nèi)參基因CT 值）表示樣本中目的基因的相對表達量， CT 越高，表達量越低。vii：統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，對其腫瘤組織中mi-RNA99a表達量（Ct值）進行獨立樣本的t檢驗。相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。對腫瘤惡性程度（

22、G1-G2和G3)，腫瘤的臨床分期（I-II和III-IV)分組不同的無進展生存期差異,進行l(wèi)og-rank檢驗,并分別采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線；多因素分析釆用Cox比例風險回歸模型進行分析。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床病理因素：臨床分期、mi-RNA99a表達量納入Cox比例風險回歸模型進行綜合分析,變量篩選采用逐步向前回歸法,以PS 0. 05為納入標準，P0. 10為剔除標準?？珊唵卫L制如下統(tǒng)計表格：RTqPCR檢測膀胱上皮癌和正常膀胱上皮組織中差異mi-RNA99a基因的表達（xs）標本分組 標本數(shù) mi-RNA99a基因的表達檢測值 正常 20分級 I級 10

23、 II級 10 III級 10分型 浸潤性 20 非浸潤性 30 1李先承，李秀男，宋希雙MicroRNA 與實體腫瘤關(guān)系的研究進展J 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， ，（） ： 三、實施本項目已具備的條件（說明已具備的試驗手段、技術(shù)力量、前期科研基礎(chǔ)情況）1：檢測miRNA的方法：目前已經(jīng)開發(fā)出多種miRNAs 的表達檢測手段，如Northem blotting 、實時定量PCR （RTPCR）、基因芯片技術(shù)等。Northem blotting 是基于分子雜交的檢測技術(shù)，它是最先運用于miRNAs 的半定量檢測，視作該檢測的金標準1。RT PCR是現(xiàn)今miRNAs 應(yīng)用得最廣泛的定量檢測方法，其中常用的

24、有polyA 聚合酶加尾法和莖環(huán)法（stemloop）2。通過對比這兩類基于PCR 技術(shù)的miRNAs 定量檢測方法的基本原理和試驗流程，比較了它們技術(shù)間的異同，認為莖環(huán)引物法能夠檢測到pg miRNAs,而加尾法能檢測到pg 的miRNAs ，前者的靈敏性更高?；蛐酒夹g(shù)（DNA microarray） ，其工作原理也是通過分子雜交進行定性與定量分析。但是基因芯片可以一次性分析數(shù)萬個基因，進行miRNAs高通量篩選和分析。并可以經(jīng)實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)（QRPCR）驗證膀胱癌組織差異表達的miRNAs。最近，也有研究者運用熒光DNA 探針技術(shù)來分析成熟miRNAs3?，F(xiàn)今miRNA調(diào)

25、控與膀胱癌的關(guān)系研究著眼于表達譜研究(miRNA profile)及功能性實驗（functional experiment)。表達譜研究指已知正常組織細胞中表達的特定多個miRNA，比較相關(guān)腫瘤組織(如膀胱內(nèi)正常尿路上皮對應(yīng)尿路上皮癌組織)內(nèi)這些miRNA表達水平的變化4。功能性實驗旨在確定某些miRNA是否調(diào)控已知原癌或者抑癌基因的表達，即確定miRNA調(diào)控的靶點5。2: 科研技術(shù)力量：鄭州大學(xué)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室為河南省級醫(yī)學(xué)研究實力較強的科研機構(gòu)，成立以來每年可支配大量科研經(jīng)費，擁有許多具有碩士或博士學(xué)位的專業(yè)技術(shù)人員和完成該實驗所需的大型儀器。統(tǒng)計處理方案方面可以請

26、教公共衛(wèi)生學(xué)院的各位資深統(tǒng)計學(xué)者作指導(dǎo)。醫(yī)學(xué)院研究方面與一附院合作緊密。通過病理科資深專家和泌尿外科手術(shù)室的協(xié)助，可謂是如虎添翼。3：前期科研基礎(chǔ)：人員：資深病理學(xué)家對膀胱癌患者標本的采集，專業(yè)從事mi-RNA基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)者，專業(yè)的公共衛(wèi)生學(xué)院的統(tǒng)計學(xué)者，嫻熟泌尿外科手術(shù)專家財政：可以申請專門的實驗經(jīng)費來完成這個項目，國家自然基金，青年基金，學(xué)校科研部門經(jīng)費的支持等。硬件環(huán)境：專業(yè)的現(xiàn)代化分子研究實驗室，各種現(xiàn)代化研究大型儀器已完成科研成果：相關(guān)專家對于mi-RNA家族其它部分成員有深刻的研究，對于試驗中發(fā)現(xiàn)的新的生化指標應(yīng)用于臨床診治有著一套熟悉的流程，科學(xué)的推斷，嚴謹?shù)恼撟C。這些

27、資料可以通過文獻獲得。、1Cissell K A ，Deo S K Trends in microRNA detectionJ Anal Bioanal Chem ，2009，394（4）：1109 10162陳新，曾長英，盧誠，等基于PCR 技術(shù)的miRNA 定量檢測方法J。中國生物工程雜志，2010 ，30（11） ：88-93 3Kato Y An efficient fluorescent method for selectivedetection of mature miRNA speciesJ Nucleic Acids SympSer （Oxf），2008，52 （1） ：71-

28、724Volinia S，Calin GALiu CG。el a1A microRNA expression siguature of human solid tumors de?nes cancer gene targetsProc Nail Acad Sci USA。2006。103：2257226I5Lindow MGorodkin JPrinciples and limitations of computationalmicroRNA gene and target?ndingDNA Cell Biol。2007。26：339351四、項目的預(yù)期經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益目前，膀胱癌的發(fā)病率

29、在世界范圍內(nèi)有上升趨勢，這種變化在我國尤其明顯。關(guān)于癌癥發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等基礎(chǔ)方面的研究發(fā)展迅速。miRNAs 在膀胱癌中抑制或者促進癌癥演變的報道越來越多，其具體作用機制尚不了解。但是，隨著基因芯片和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為miRNAs 的研究提供了難得的機遇。研究方向上，深入探討miRNAs 作用機制仍是主要任務(wù)之一，應(yīng)注重系統(tǒng)性研究，確定重要miRNAs 的位點基因，研究不同miRNAs 的協(xié)作機制，開發(fā)用于診斷與預(yù)后評估的特異miRNAs 譜。我們相信，隨著研究的逐步深入， miRNAs 參與生命活動的分子機制將會更加明朗。這將為寄予厚望的分子診斷和靶向治療提供新的切入點，為膀胱癌的預(yù)后判斷提供有力的科學(xué)依據(jù)。miRNA的研究前