SEC對(duì)淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的誘導(dǎo)作用

1、SEC對(duì)淋巴細(xì)胞分泌TNF-的誘導(dǎo)作用安徽醫(yī)學(xué)2006年第27卷第5期SEC對(duì)淋巴細(xì)胞分泌TNF一)【的誘導(dǎo)作用王凡黃強(qiáng)周麗英摘要目的探討超抗原SEC的抗癌作用機(jī)制.方法采用ELISA法測(cè)定SEC在不同濃度及作用時(shí)間促淋巴細(xì)胞分泌TNFa的作用;采用RTPCR法檢測(cè)SEC在不同作用時(shí)間促進(jìn)淋巴細(xì)胞表達(dá)TNFa的mRNA.結(jié)果ELISA法顯示:淋巴細(xì)胞在未經(jīng)SEC激活之前,培養(yǎng)上清液中TNFa較低,經(jīng)SEC激活后的第1天,培養(yǎng)上清液中TNFa迅速上升,到作用的第3天,TNFa上升至峰值.RTPCR顯示:經(jīng)SEC活化的淋巴細(xì)胞有大量TNFamRNA的表達(dá),高峰出現(xiàn)于第3天.結(jié)論SEC能促進(jìn)淋巴細(xì)胞

2、大量分泌TNFa.關(guān)鍵詞金葡菌腸毒素C;超抗原;淋巴細(xì)胞;腫瘤壞死因子一aTunlornecrosisllact0lrOtsecretionoflymphocytestimulatedbySECWangFan,HuangQ,ZhouUyingDepartmentofRadiationOncology,FirstAffiliatedHospital,AnhuiMedicalUmvershy,Hefei230022AbstradObjectiveProbetoantitumormechanismofsuperantigenSEC.MeodsWemeasuredlNFainlym-phocytest

3、imulatedbySEC(indifferentdoseandtime)withELISAmethod;mRNAexpressionwasmeasuredbyusingRTPCR.ResultsAPAAPshows:ThereislittleINFabeforeusingSEC.ThelymphocytestimulatedbySECbegantosecreteINFctgreatlyatfirstday.Secretingamountreachedpeakatthethirddayanddecreasedslowlyatthe5,7,hday;RTPCRshows:Lymphocyteac

4、tivatedhaveexpressedmRNAoflNFa,contrasttothis,thelymphocyteunaetivateddidnotexpressedanymRNAofeytokine.ConclusionSECCaninducelymphocytetosecreteINFaKeywordsStaphylococcalenterotoxin;Superantigen;Lymphocyte;Tumornecrosisfactora生物治療現(xiàn)已被公認(rèn)為除手術(shù),放療和化療外的第四種腫瘤治療手段.高聚生作為一種超抗原,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體臨床試驗(yàn),均顯示出強(qiáng)大的抗瘤作用.本文通過(guò)觀察金

5、葡菌腸毒素C型(staphylococ.calenterotoxinC,SEC)對(duì)淋巴細(xì)胞分泌TNF一僅的誘導(dǎo)作用,試圖對(duì)SEC高聚生的抗瘤作用機(jī)制進(jìn)行闡明.資料與方法1.儀器相差顯微鏡:Nikon,日本.二氧化碳培養(yǎng)箱,ESOECBAN一311型,日本.離心機(jī):LIM一2A,北京醫(yī)用離心機(jī)廠.DNA熱循環(huán)儀:PE公司.電泳儀:TS600,上海復(fù)旦生物工程研究所.全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀:HYPERION,USA.2.主要試劑SEC,沈陽(yáng)協(xié)合制藥廠.FicollHypaque淋巴細(xì)胞分離液,比重1.0770.022,上海試劑二廠.RPMI1640培養(yǎng)液,Sigma公司.小牛血清,杭州四季青生物工程

6、材料研究所.RNA抽提試劑TRIZOL及cDNA合成試劑盒,GIBCOBRL公司產(chǎn)品.357高保真Taq酶及dNTPS,Sigma公司產(chǎn)品.TFN一僅檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司.3.淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)及活動(dòng)取健康志愿者靜脈血50na(肝素1250U),100mlPBS稀釋,小心加人到等體積的淋巴細(xì)胞分離液,2000r/min離心20分鐘,小心吸出中層的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcel1)層,加5倍PBS稀釋,1000r/min離心5分鐘,棄上清,將沉淀置于RPMI1640完全培養(yǎng)基(含20%小牛血清,青鏈霉素各100U/m1)3750%C

7、O:飽和濕度下培養(yǎng),在上述培養(yǎng)基中加人SEC,使其終濃度分別為10U/ml,5U/ml,2.5U/Tnl,0u/Tnl.于用藥前及用藥后的第1,3,5,7天離心,收集上清液及淋巴細(xì)胞,分別置于一20及一80冰箱保存?zhèn)溆?4.ELISA檢測(cè)淋巴細(xì)胞上清液TNF一采用雙抗體夾心法,取出已平衡至室溫的板條,加人標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100至空白孔和零孔,加人上述收集的上清液和已稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各100至相應(yīng)孔中,用封板膠紙封住反應(yīng)孔,3790分鐘,洗滌液洗板4作者單位:230022合肥安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科蘇州大學(xué)附二院腦腫瘤研究室(黃強(qiáng),周麗英)358次,除空13L#t,每孔加入已稀釋好的

8、生物學(xué)標(biāo)記二抗100IXl,封住板孔,37C60分鐘,洗滌液洗板4次,除空白孔外,每孔加已稀釋好的酶聯(lián)物100IXl,封住板孔,3730分鐘,洗板液洗板4次,每孔加底物A,B各1滴,避光37C15分鐘,每孔加終止液1滴,混勻,即刻在450nm處讀數(shù).5.RTPCR檢測(cè)細(xì)胞因子和表達(dá)(1)總RNA抽提:取上述備用的淋巴細(xì)胞,PBS洗2遍,在1X10.細(xì)胞加入1mlTrizol裂解液,反復(fù)吹打置室溫5分鐘,加入0.2ml氯仿,劇烈振搖l5秒,室溫靜置3分鐘于413500g離心l5分鐘,轉(zhuǎn)移上層水相,加入0.5ml異丙醇并混勻,室溫靜置l0分鐘,于413500g離心l0分鐘,棄上清,加入1ml75%

9、乙醇,震蕩混勻,于4C7500g離心5分鐘,棄上清,超凈臺(tái)內(nèi)干燥5分鐘,加入50IXlDEPC處理水,溶液于5560,水浴l0分鐘,分光光度計(jì)分析并定量,置一80備用.(2)cDNA的合成:取5(1)抽提的RNA3,OligodT1(0.5g/m1)DEPC處理水l2,置于70水浴l0分鐘,冰上冷卻3分鐘,加入預(yù)先混勻的PCR反應(yīng)混合液7l(10X反應(yīng)緩沖液2l,25mmol/L氯化鎂2l,10mmol/LdNTP1IXl,0.1mol/LDTr21),輕輕混勻后置425分鐘,加入1IXlMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/m1),混勻后于42反應(yīng)50分鐘,置72C15分鐘終止反應(yīng),冰上冷卻l0分鐘,

10、離心收集反應(yīng)液,加入1RnaseH于37反應(yīng)20分鐘,置一20備用.(3)引物合成:上海SANGER公司產(chǎn)品BactinF:5一AGCAAGAGAGGCATCCTCAC一3R-5一GCAGCTCATTGTAGAAGGTGT一3TNF一F:5一TGTAGGCTCGAGGTCAGATCATCTTCTCGAAC一3R:5一GCTACCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAG一3(4)PCR擴(kuò)增:在50反應(yīng)體系中,加入10XPCR緩沖液5,氯化鎂(25mmol/L)2,dNTP(10mmol/L)1.2IXl,上,下游引物(10mmol/L)各2l,模板cDNA2IXl,TaqplusDNA

11、聚合酶1.循環(huán)條件:947分鐘變性,然后9460秒,5730秒及7290秒,循環(huán)30次,72延長(zhǎng)7分鐘.2%瓊脂糖凝膠電泳.安徽醫(yī)學(xué)2006年第27卷第5期結(jié)果1.SEC活化淋巴細(xì)胞前后的TNF一檢測(cè)結(jié)果SEC活化淋巴細(xì)胞前后培養(yǎng)上清液中的TNF一在未經(jīng)SEC激活之前,培養(yǎng)上清液中TNF一較低,在37.4476.24pg/ml之間,經(jīng)SEC激活后的第1天,培養(yǎng)上清液中TNF一迅速上升,到作用的第3天,TNF一上升至峰值,其中SEC10單位/Inl劑量組的TNF一上升到541.87pg/ml,到第5天及第7天,TNF一開(kāi)始下降,從不同劑量組顯示的激活效果看,SEC10U/ml劑量組激活淋巴細(xì)胞的

12、作用最強(qiáng),見(jiàn)圖1.e差7oo6oo5004oo30O20oloo0用藥前第1天第3天第5天第7天作用對(duì)同圖1SEC促淋巴細(xì)胞分泌TNFn作用2.SEC激活淋巴細(xì)胞mRNA的表達(dá)我們采用RTPCR法對(duì)SEC(10U/In1)作用前后的淋巴細(xì)胞(用藥前,第1,3,5,7天)進(jìn)行TNF一進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與Bactin相比較,經(jīng)SEC活化的淋巴細(xì)胞均分泌表達(dá)TNF一mRNA,其中以第3,5天表達(dá)量最高,見(jiàn)圖2.圖2SEC促淋巴細(xì)胞表達(dá)TNFn結(jié)果討論1543腳697bp5I5bp3771237bp從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,ELISA從蛋白質(zhì)水平和RtPCR從mPNA水平檢測(cè)的結(jié)果都可證實(shí).SEC誘生的CTL在S

13、EC刺激PBMC第1天就開(kāi)始分泌細(xì)胞因子:TNF一可持續(xù)57天,其中,最大分泌出現(xiàn)在第35天.這些細(xì)胞因子可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接的殺傷.多年來(lái)許多腫瘤學(xué)者,特別是腫瘤免疫學(xué)家,曾設(shè)想應(yīng)用腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)來(lái)防治腫瘤J.這是非常令人向往的設(shè)想,因?yàn)闄C(jī)體殺傷安徽醫(yī)學(xué)2006年第27卷第5期瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞是CTL,并具有特異性,既對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的殺傷作用,而又無(wú)損于正常細(xì)胞,比化療優(yōu)越.IL一2問(wèn)世以來(lái),將IL一2與瘤細(xì)胞或腫瘤抗原,淋巴細(xì)胞在體外共孵,不僅可誘導(dǎo)出該腫瘤特異性CTL,以殺傷瘤細(xì)胞,而且使CTL呈指數(shù)級(jí)增殖,注人體內(nèi)的CTL可高達(dá)510,未見(jiàn)任何毒性反應(yīng).

14、因此,世界上有權(quán)威性的腫瘤研究機(jī)構(gòu)(美國(guó)國(guó)立癌癥研究所,斯隆一凱特癌癥研究所,法國(guó)腫瘤免疫藥理研究所等)都正致力于此項(xiàng)研究.美國(guó)國(guó)立癌癥研究所lotzw等將3例肺部有轉(zhuǎn)移的肉瘤病人PBL(1210)培養(yǎng)于IL一2與肉瘤細(xì)胞中,經(jīng)34周后,CTL增殖到11010,可維持生長(zhǎng)達(dá)數(shù)月,且對(duì)自身肉瘤細(xì)胞的殺傷作用增加23倍,如新鮮淋巴細(xì)胞對(duì)瘤細(xì)胞的殺傷作用為85.01.9CPM,經(jīng)IL一2孵育的CTL,增至253.64-15.4CPM.超級(jí)抗原是一種潛在的高效的T淋巴細(xì)胞激活劑.被超抗原激活的T淋巴細(xì)胞即CTL,其胞漿內(nèi)積聚很多穿孔素和粒酶,通過(guò)細(xì)胞排粒作用分泌到瘤細(xì)胞上,聚集形成孔道,一些效應(yīng)分子如

15、粒酶,TNF,分泌性ATP,多腺苷酸結(jié)合蛋白TIA一1等可以從孔道進(jìn)人瘤細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞死亡.6J.關(guān)于TNFd在腫瘤免疫反應(yīng)中的作用,體外實(shí)驗(yàn)早已證實(shí)TNFd可使腫瘤細(xì)胞壞死.研究發(fā)現(xiàn),TNFd誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用,可通過(guò)誘導(dǎo)靶細(xì)胞調(diào)亡這一途徑實(shí)現(xiàn),腫瘤靶細(xì)胞表面有一種名為FAS(APO一1)分子是TNF受體家族成員,Fas有三個(gè)跨細(xì)胞膜區(qū)和一個(gè)胞漿尾端(死亡區(qū))這與TNFR(P55)同源,后者的死亡區(qū)與Fas完全一樣.Fas與效應(yīng)細(xì)胞相結(jié)合迅速可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡,同理,細(xì)胞表面和可溶性TNF與TNFR結(jié)合后,亦發(fā)出死亡信號(hào)導(dǎo)致腫瘤靶細(xì)胞調(diào)亡.此外,TNF與處于間期的腫瘤細(xì)胞質(zhì)模表面的特異性受

16、體結(jié)合,TNF一受體復(fù)合物在細(xì)胞表面形成帽狀聚集并人胞形成胞內(nèi)小囊,小囊沿微管移動(dòng)與溶酶體融合,在分裂期,由于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)變脆,在TNF的359作用下,溶酶體容易破裂,釋出溶酶體酶致細(xì)胞自溶.除了上述TNFd直接作用于腫瘤細(xì)胞,顯示出殺傷活性外,TNFd還可使腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)粘附分子LFA一1,CD2及ICAM一1,從而增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的粘附性.另外TNFd作用于腫瘤細(xì)胞,使其增強(qiáng)MHC一1類及類分子的表達(dá),提高CD或CD細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力.TNFd還可通過(guò)其它細(xì)胞因子活化的效應(yīng)細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞J.超抗原活化的T細(xì)胞能分泌多種足量的細(xì)胞因子,包括FB,IFN一IL一2或IL一12.

17、本文的實(shí)驗(yàn)亦表明:經(jīng)SEC活化的淋巴細(xì)胞有NTFd的mRNA的表達(dá)及NTFd蛋白的分泌.參考文獻(xiàn)lBernhardT.Superanrigen.APMIS,1994;102:3l22DohlstenM,SundstedtA,BjorldundM,eta1.Superangeninducedcytokinessuppressgrowthofhumancoloncarcinomacells.IntJCancer.1993;54:4824883黃強(qiáng)主編.腦腫瘤分子外科學(xué).北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社.1998:1221314MaestrelliP,TsaiJJ,Cromwell0,eta1.Theide

18、ntificationandpartialcharacterizationofahumanmonounclearcellderivedneutrophilchemotacticfactorapparentlydistinctfromIL一1.IL一2,GMCSF,TNFandIFN.Immunology,1988;64:2192255CallahanJE,HermanA,KapplerJW,eta1.StimulationofB10.BRTcellswithsuperantigenicstaphylococcalentemtoxins.JImmuno1.1990;144:247324796JohnsonHM,TorresBA,SoosJM,superantigens:structureandrelevancetohumandisease.PSEBM,l9SI6;212:99l097DohlstenMSundstedtA,BjorldundM,eta1.Superantigenin-ducedcytokinessuppressgrowthofhumancolcncarcinomacells.IntJCancer.1993;54