DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

1、一、粘末端一、粘末端dna片段的連接片段的連接（一）具有相同粘末端（一）具有相同粘末端的的dna分子之間的連接分子之間的連接 使用堿性磷酸酶使用堿性磷酸酶處理載體處理載體dna，去掉其去掉其5末端末端的磷酸基，以防的磷酸基，以防質(zhì)粒質(zhì)粒dna的自身的自身環(huán)化環(huán)化 。（二）（二）具有不同粘性末端的具有不同粘性末端的dna分子之間的連接分子之間的連接 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源dna進(jìn)行切進(jìn)行切割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)dna連接酶連接酶連接連接后即產(chǎn)生定向重組體。后即產(chǎn)生定向重組體。 hindii

2、iecorihindiiiecori對(duì)載體酶切hindiiiecori對(duì)基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組質(zhì)粒載體的定向重組1、直接用t4連接酶連接3、銜接物連接法銜接物連接法銜接物銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個(gè)核苷酸組成，具個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。4、dna接頭連接法接頭連接法 接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端，先接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端，先利用齊平末端連接方法將它與平端的外源利用齊平末端連接方法將它與平端的外源dna連

3、接起來，造成連接起來，造成人工粘性末端，即可再與之互補(bǔ)的粘性末端的載體人工粘性末端，即可再與之互補(bǔ)的粘性末端的載體dna相連接。相連接。 所謂載體與所謂載體與dna片段酶切位點(diǎn)不匹配，指載體與待克隆的片段酶切位點(diǎn)不匹配，指載體與待克隆的dna片段上的酶切位點(diǎn)不相同，因而用一種或兩種酶切制片段上的酶切位點(diǎn)不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補(bǔ)的粘性末端。造不出可互補(bǔ)的粘性末端。 1、按照平末端連接方法加上接頭。、按照平末端連接方法加上接頭。2、將凹端變?yōu)槠蕉恕级俗優(yōu)槠蕉耍? 1）使用）使用klenowklenow酶在酶在4 4種種dntpdntp存在下，將存在下，將33凹端完全補(bǔ)平。凹端

4、完全補(bǔ)平。 （2 2）用）用s1核酸酶去除核酸酶去除3突出末端產(chǎn)生平端突出末端產(chǎn)生平端dna分子分子 3 3、使用大腸桿菌、使用大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i klenow片段部分補(bǔ)平片段部分補(bǔ)平3凹凹端轉(zhuǎn)變成粘端。端轉(zhuǎn)變成粘端。tcgaagctgatcctag載體經(jīng)載體經(jīng)xhoi酶切形成：酶切形成：外源基因用外源基因用san3a酶切形成：酶切形成：用用klenow酶部分補(bǔ)平二者的酶部分補(bǔ)平二者的3 凹端，形成：凹端，形成：tcgaagctgatcctagcttcagga這樣，就可以實(shí)現(xiàn)有效重組。這樣，就可以實(shí)現(xiàn)有效重組。33335555通過依次加入、連接合成的dna接頭進(jìn)行cdna克隆外源基因

5、與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（1）（2）（3）轉(zhuǎn)化e.coli（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1、抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法、抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法例：例：pbr322pbr322 如果外源基因插入到如果外源基因插入到tetr基因內(nèi)部，基因內(nèi)部，tetr抗性消失，表型抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（為不抗四環(huán)素（tets）、）、而仍抗氨芐青霉素（而仍抗氨芐青霉素（ampr），），這樣的這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有 amp的培養(yǎng)基仍可生長(zhǎng)，但在含有四環(huán)素的的培養(yǎng)基仍可生長(zhǎng)，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基

6、上不能再生長(zhǎng)；反之，如果培養(yǎng)基上不能再生長(zhǎng)；反之，如果ampr基因由于外源基因插基因由于外源基因插入其內(nèi)部而失活，帶有重組入其內(nèi)部而失活，帶有重組dna分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有tet的的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，在含有培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，在含有 amp的培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)。的培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)。 插入失活法篩選重組子插入失活法篩選重組子例；例；puc質(zhì)粒質(zhì)粒 在在lacz的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細(xì)胞中引入若在該細(xì)胞中引入puc質(zhì)粒，其上有質(zhì)粒，其上有l(wèi)acz，質(zhì)粒和大腸桿質(zhì)粒和大腸桿菌菌dna可實(shí)現(xiàn)可實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，菌落呈藍(lán)色?；パa(bǔ)，菌

7、落呈藍(lán)色。 如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個(gè)酶切點(diǎn)上克隆了外源基如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個(gè)酶切點(diǎn)上克隆了外源基因，則因，則lacz基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。 （二）（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體 進(jìn)入受體細(xì)胞的重組進(jìn)入受體細(xì)胞的重組dna分子中的外源基因如果在宿主分子中的外源基因如果在宿主細(xì)胞中能實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出有功能活性的基因產(chǎn)物，那細(xì)胞中能實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出有功能活性的基因產(chǎn)物，那么鑒定此種重組體最簡(jiǎn)便的方法就是

8、表型特征的直接選擇法。么鑒定此種重組體最簡(jiǎn)便的方法就是表型特征的直接選擇法。 1、凝膠電泳檢測(cè)法在臨近雙鏈在臨近雙鏈dna變性溫度下和高濃度（變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，）的甲酰胺溶液中，即所謂的即所謂的r-環(huán)條件下，雙鏈的環(huán)條件下，雙鏈的dna-rna分子要比雙鏈的分子要比雙鏈的dna-dna分子更為穩(wěn)定。因此，將分子更為穩(wěn)定。因此，將rna和和dna的混合物置于這種的混合物置于這種條件下，條件下，rna便會(huì)同雙鏈便會(huì)同雙鏈dna分子中與之互補(bǔ)的序列退火形分子中與之互補(bǔ)的序列退火形成穩(wěn)定的成穩(wěn)定的 dna-rna雜交分子，而另一條雜交分子，而另一條dna鏈則成為單鏈狀鏈則成為

9、單鏈狀態(tài)。這種由單鏈態(tài)。這種由單鏈dna分支和雙鏈分支和雙鏈dna-rna分支形成的分支形成的“泡狀泡狀”體，叫做體，叫做r-環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)結(jié)構(gòu)。 例：例：原位雜交篩選重組原位雜交篩選重組體菌落體菌落(或噬菌斑或噬菌斑) 免疫化學(xué)檢測(cè)法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基免疫化學(xué)檢測(cè)法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個(gè)重組克隆中的外源基因能夠表達(dá)，在這個(gè)克隆因的。如果某個(gè)重組克隆中的外源基因能夠表達(dá)，在這個(gè)克隆中就存在著這個(gè)基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測(cè)。中就存在著這個(gè)基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測(cè)。常用的有標(biāo)記抗體測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法兩種常用的有標(biāo)記抗體測(cè)

10、定法和免疫沉淀測(cè)定法兩種 。轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)化菌落影印平板影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器置于含氯仿飽合氣體的容器細(xì)菌裂解，抗原釋放細(xì)菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經(jīng)標(biāo)記的抗體的覆蓋吸附有未經(jīng)標(biāo)記的抗體的nc膜膜形成抗原抗體復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物將將nc膜與膜與i125標(biāo)記的抗體溫育標(biāo)記的抗體溫育 放射自顯影放射自顯影與母板對(duì)照，挑取所需的重組克隆與母板對(duì)照，挑取所需的重組克隆 標(biāo)記抗體測(cè)定法的步驟：標(biāo)記抗體測(cè)定法的步驟：用免疫化學(xué)法檢測(cè)克隆在表達(dá)載體用免疫化學(xué)法檢測(cè)克隆在表達(dá)載體puc8上的基因上的基因六、轉(zhuǎn)譯篩選法六、轉(zhuǎn)譯篩選法 原理：原理： 外源外源dna蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯能與某一能與某一特

11、定特定dna序列結(jié)合序列結(jié)合作為探針與克隆群體雜交作為探針與克隆群體雜交 轉(zhuǎn)譯篩選法是通過體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽(yáng)性克隆的方法，轉(zhuǎn)譯篩選法是通過體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽(yáng)性克隆的方法，可分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種方法?？煞譃殡s交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種方法。 要求：被研究的目的基因編碼有豐富的要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mrna 。dna蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)mrna蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)雜交原理：原理：步驟：步驟：轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)化菌落提取重組提取重組dna與與mrna總雜交總雜交形成形成dna-rna雜種分子雜種分子將總將總mrna（包括包括dna-rna分子分子提取出來提取出來體外轉(zhuǎn)譯體外轉(zhuǎn)譯蛋白電泳放射自

12、顯影蛋白電泳放射自顯影 （1）總總mrna體外轉(zhuǎn)譯體外轉(zhuǎn)譯蛋白電泳放射自顯影蛋白電泳放射自顯影 （2）經(jīng)對(duì)比，（經(jīng)對(duì)比，（1）比（）比（2）中少了一種蛋白質(zhì)中少了一種蛋白質(zhì)找到一種轉(zhuǎn)譯作用找到一種轉(zhuǎn)譯作用被抑制了的被抑制了的mrna 篩選出重組菌落篩選出重組菌落（或噬菌斑）（或噬菌斑） 觀察到觀察到在這種雜交選擇的轉(zhuǎn)譯中，存在著一種特殊活躍在這種雜交選擇的轉(zhuǎn)譯中，存在著一種特殊活躍的的mrna。重組體庫(kù)重組體庫(kù)提取提取dna固定在固定在nc膜上膜上與與mrna或總或總rna雜交雜交目的基因與對(duì)應(yīng)的目的基因與對(duì)應(yīng)的mrna雜雜交，交，mrna固定在固定在nc膜上膜上將分離將分離mrna的的進(jìn)行體

13、外轉(zhuǎn)譯進(jìn)行體外轉(zhuǎn)譯凝膠電泳或生物活性檢測(cè)凝膠電泳或生物活性檢測(cè)找出單菌落重組體找出單菌落重組體一、一、重組重組dna導(dǎo)入大腸桿菌導(dǎo)入大腸桿菌 （一）（一）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 將外源將外源dna分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程都叫分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程都叫轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。 為了有效地使細(xì)菌吸收外源的為了有效地使細(xì)菌吸收外源的dna分子，我們通常要對(duì)它們分子，我們通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細(xì)胞吸收外源進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細(xì)胞吸收外源dna的的能力大大提高，被稱為能力大大提高，被稱為感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞，一般采用對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞，一般采用50mmol/l的的

14、cacl2溶液來制備溶液來制備感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞。（1）吸附階段：完整的雙鏈）吸附階段：完整的雙鏈dna分子吸附于感受態(tài)細(xì)胞表面。分子吸附于感受態(tài)細(xì)胞表面。（2）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈dna分子解鏈，以單鏈形式進(jìn)入細(xì)胞，分子解鏈，以單鏈形式進(jìn)入細(xì)胞，而另一鏈則被降解。而另一鏈則被降解。（3）自身穩(wěn)定階段；外源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)型）自身穩(wěn)定階段；外源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)型dna。（4）表達(dá)階段：即目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被表達(dá)階段：即目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯。轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯。dna分子轉(zhuǎn)化的過程：分子轉(zhuǎn)化的過程：質(zhì)粒質(zhì)粒dna的大小及構(gòu)型對(duì)轉(zhuǎn)

15、化效率的影響：的大小及構(gòu)型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響：（1）大小 10kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型 超螺旋環(huán)形線狀（2）噬菌體的體外包裝噬菌體的體外包裝轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細(xì)胞捕獲和表達(dá)以是指感受態(tài)的受體細(xì)胞捕獲和表達(dá)以噬菌體為載體的重組噬菌體為載體的重組dna分子的過程。分子的過程。 （1）轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別）轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：通過通過噬菌體（病毒）顆粒感染噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源宿主細(xì)胞的途徑把外源dna轉(zhuǎn)移到受體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程細(xì)胞的過程。 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：噬菌體噬菌體dna分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。分子直接導(dǎo)

16、入受體細(xì)胞的過程。 體外包裝：是指在體外模擬體外包裝：是指在體外模擬噬菌體噬菌體dna在受體細(xì)胞內(nèi)的一在受體細(xì)胞內(nèi)的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬菌體噬菌體dna分子包裝成分子包裝成為成熟的具有感染能力的為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。噬菌體顆粒的技術(shù)。根據(jù)噬菌體噬菌體dna的體內(nèi)包裝途徑，分別獲得缺失的體內(nèi)包裝途徑，分別獲得缺失d包裝包裝蛋白的蛋白的噬菌體突變株和缺失噬菌體突變株和缺失e包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變噬菌體突變株。由于不具備完整的包裝蛋白，這兩種突變株均不能株。由于不具備完整的包裝蛋白，這兩種突變株均不能單獨(dú)包裝單獨(dú)包裝噬菌體噬菌體d

17、na，但將兩種突變株分別感染大腸但將兩種突變株分別感染大腸桿菌，從中提取缺失蛋白桿菌，從中提取缺失蛋白d的包裝物（含的包裝物（含e蛋白）和缺失蛋白）和缺失e蛋白的包裝物（含蛋白的包裝物（含d蛋白），兩者混合后就能包裝蛋白），兩者混合后就能包裝噬噬菌體菌體dna。（一）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法（一）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法 1、共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法(cocultivation) 該方法是該方法是marton等等1979年以原生質(zhì)體為受體建立起來的，隨后年以原生質(zhì)體為受體建立起來的，隨后經(jīng)過一系列的改進(jìn)，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉(zhuǎn)化經(jīng)過一系列的改進(jìn)，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉(zhuǎn)化方法。該方法的主要原

18、理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接方法。該方法的主要原理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接觸感染而發(fā)生轉(zhuǎn)移，供體常用農(nóng)桿菌、病毒載體等形式。觸感染而發(fā)生轉(zhuǎn)移，供體常用農(nóng)桿菌、病毒載體等形式。 （1）原生質(zhì)體）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法 取含重組取含重組ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長(zhǎng)出細(xì)胞壁的原生質(zhì)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長(zhǎng)出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。從煙草無菌苗中分離原生質(zhì)體，并預(yù)培養(yǎng)從煙草無菌苗中分離原生質(zhì)體，并預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。小時(shí)。原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，原生質(zhì)體濃度原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，

19、原生質(zhì)體濃度l05ml、農(nóng)桿農(nóng)桿菌菌l07ml，20下保溫下保溫32小時(shí)。小時(shí)。沖洗去游離的細(xì)菌，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在有抗生素沖洗去游離的細(xì)菌，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在有抗生素(250mgl萬(wàn)古霉素，萬(wàn)古霉素，200mgl羧芐青霉素，羧芐青霉素，200mgl鏈霉素鏈霉素)的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，這些抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而對(duì)原生質(zhì)體無毒害?；?，這些抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而對(duì)原生質(zhì)體無毒害。3周后，離心收集細(xì)胞團(tuán)，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，周后，離心收集細(xì)胞團(tuán)，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，2周內(nèi)，周內(nèi)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)是激素非依賴性生長(zhǎng)細(xì)胞團(tuán)，在該培養(yǎng)基中可快轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)是激素非依賴性生長(zhǎng)細(xì)胞團(tuán)，在該培養(yǎng)基中可快速生長(zhǎng)，而非

20、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)則生長(zhǎng)很慢，最后變褐死亡。速生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)則生長(zhǎng)很慢，最后變褐死亡。 煙草原生質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體與ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的共培養(yǎng)法程序?yàn)橘|(zhì)粒轉(zhuǎn)移的共培養(yǎng)法程序?yàn)椋簣D該方法最早由該方法最早由horsch(1985)首創(chuàng)，首創(chuàng)，用于煙草轉(zhuǎn)化用于煙草轉(zhuǎn)化 。優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，對(duì)于那些能優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，對(duì)于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。再生植株的各種植物均適用。（4）活體接種）活體接種(inoculation in vivo) 原則上，該種共培養(yǎng)與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法和步驟是相原則上，該種共培養(yǎng)與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法和步驟是相同的，在供體上

21、，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，同的，在供體上，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，如帶有如帶有ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。 所謂整體植株接種轉(zhuǎn)化法，是指人為地在整體植株上造成所謂整體植株接種轉(zhuǎn)化法，是指人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi)，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過桿菌注射到植物體內(nèi)，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過 程在植程在植物體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。物體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。接種后接種后2-3周，切下接種處部分組織培養(yǎng)周，切

22、下接種處部分組織培養(yǎng)4周，可產(chǎn)生愈傷周，可產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植株。組織，進(jìn)一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植株。（1）雙鏈）雙鏈dna病毒轉(zhuǎn)化載體病毒轉(zhuǎn)化載體 這類病毒是以雙鏈這類病毒是以雙鏈dna作為遺傳物質(zhì)，在這類病毒中，目作為遺傳物質(zhì)，在這類病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花葉病毒（簡(jiǎn)稱前研究的最多的是花椰菜花葉病毒（簡(jiǎn)稱camv, caullinus mozic virus）。）。 （2）單鏈）單鏈dna病毒轉(zhuǎn)化載體病毒轉(zhuǎn)化載體 genv顧名思義，可翻譯成顧名思義，可翻譯成“雙聯(lián)體病毒雙聯(lián)體病毒”或或“孿生病毒孿生病毒”。genv的感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉

23、植物，它們的的感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉植物，它們的傳播媒介是昆蟲。傳播媒介是昆蟲。 （3）單鏈）單鏈rna病毒轉(zhuǎn)化載體病毒轉(zhuǎn)化載體 迄今為止，還沒有建立起一個(gè)完善的以植物迄今為止，還沒有建立起一個(gè)完善的以植物rna病毒為基病毒為基因載體的基因轉(zhuǎn)化體系，但是因載體的基因轉(zhuǎn)化體系，但是rna病毒仍是一個(gè)很有希望病毒仍是一個(gè)很有希望作為基因工程載體的植物作為基因工程載體的植物病毒。 1、物理方法、物理方法 （1）基因槍法）基因槍法 80年代末期，由康奈爾大學(xué)的年代末期，由康奈爾大學(xué)的sanford最先提出，主要最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)

24、的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。 首先將鎢、金微粒首先將鎢、金微粒(直徑約直徑約0.4m，重量約重量約0.05mg)與供體與供體dna溶液溶液(12ll)混合并保溫，使混合并保溫，使dna吸附在金屬微粒的表面，然吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的后將該溶液置于所謂的“基因槍基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細(xì)胞，細(xì)胞擊穿成孔后，屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細(xì)胞，細(xì)胞

25、擊穿成孔后，在鎢粒上的在鎢粒上的dna以及溶液中的以及溶液中的dna都可以進(jìn)入受體細(xì)胞。都可以進(jìn)入受體細(xì)胞。 操作技術(shù)程序?yàn)椋翰僮骷夹g(shù)程序?yàn)椋夯驑屖疽鈭D基因槍所用材料：基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；）鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。金粉大。（2）將）將dna包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、cacl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動(dòng)力系

26、統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微）所用動(dòng)力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動(dòng)力；第三類以高壓彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動(dòng)力；第三類以高壓蒸汽作為動(dòng)力。蒸汽作為動(dòng)力?；驑尫ǖ奶攸c(diǎn)：基因槍法的特點(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)化效率高。）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。）受體廣泛。（3）操作簡(jiǎn)單。）操作簡(jiǎn)單。電激法是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出電激法是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。 原理：原理：細(xì)胞生物學(xué)研究證明，細(xì)胞膜的磷脂雙分子層可視為細(xì)胞生物學(xué)研究證明，細(xì)胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，

27、其靜膜電位（一種電容，其靜膜電位（vm）約為約為l00mv，導(dǎo)電性很差。導(dǎo)電性很差。當(dāng)把細(xì)胞置于外加電場(chǎng)中時(shí)，會(huì)使膜電位升高，雙分子層兩當(dāng)把細(xì)胞置于外加電場(chǎng)中時(shí)，會(huì)使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢(shì)，隨著外加電場(chǎng)電壓升高，細(xì)胞膜被壓縮變端電壓形成差勢(shì)，隨著外加電場(chǎng)電壓升高，細(xì)胞膜被壓縮變薄，當(dāng)膜電壓升到一定數(shù)值時(shí)，膜被擊穿。薄，當(dāng)膜電壓升到一定數(shù)值時(shí)，膜被擊穿。 可逆擊穿：擊穿小孔可在一定時(shí)間內(nèi)復(fù)原?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r(shí)間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細(xì)胞成活率低。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細(xì)胞成活率低。操作程序：操作程序：將盛有細(xì)胞和將盛有細(xì)胞和dna混合物的

28、特制混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負(fù)極之間，小容器置于電脈沖儀的正負(fù)極之間，在在0度度下加高壓（下加高壓（2 4kv），），電電脈沖脈沖10分鐘后，將待處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)分鐘后，將待處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)移到新鮮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天，再進(jìn)天，再進(jìn)行篩選。存活細(xì)胞的回收率約為行篩選。存活細(xì)胞的回收率約為60% 80%。微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，dna隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭道進(jìn)入。道進(jìn)入。 真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源

29、源dnadna直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。 顯微注射技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的固定。顯微注射技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的固定。對(duì)于植物細(xì)胞而言，首先必須建立固定細(xì)胞技術(shù)，然后才能對(duì)于植物細(xì)胞而言，首先必須建立固定細(xì)胞技術(shù)，然后才能進(jìn)行定位顯微注射操作。常用的細(xì)胞固定方法有進(jìn)行定位顯微注射操作。常用的細(xì)胞固定方法有3種：種：一、瓊脂糖包埋法一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法三、吸管支持法（5）超聲波法）超聲波法 此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可此方法是利用直徑很小、能

30、量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細(xì)胞周圍的外源穿孔，處于細(xì)胞周圍的外源dna分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。基本原理：是利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)胞膜基本原理：是利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)胞膜造成通道，使外源造成通道，使外源dna進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞。 利用利用超聲波處理可避免脈沖高壓對(duì)細(xì)胞的損傷作用，有利于超聲波處理可避免脈沖高壓對(duì)細(xì)胞的損傷作用，有利于原

31、生質(zhì)體的存活，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。原生質(zhì)體的存活，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。（6）離子束法）離子束法 離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象一把手術(shù)刀，對(duì)生物體進(jìn)行微細(xì)加工，使生物體表面層層剝離，一把手術(shù)刀，對(duì)生物體進(jìn)行微細(xì)加工，使生物體表面層層剝離，原來不連通的通道在一定距離內(nèi)連通，后來的離子就可穿行較原來不連通的通道在一定距離內(nèi)連通，后來的離子就可穿行較長(zhǎng)的距離，落在預(yù)定的位置上。長(zhǎng)的距離，落在預(yù)定的位置上。 （1）peg法法 是細(xì)胞融合劑，它可以使細(xì)胞膜之間或是細(xì)胞融合劑，它可以使細(xì)胞膜之間或dna與膜之間形與膜之間

32、形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，從而有利于細(xì)胞膜之面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，從而有利于細(xì)胞膜之間的融合和外源間的融合和外源dna進(jìn)入原生質(zhì)體。進(jìn)入原生質(zhì)體。(2)脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，可將脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，可將dna包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源dna轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。早期：絲氨酸磷酸早期：絲氨酸磷酸+

33、膽固醇膽固醇第二代：二油酰乙醇胺磷脂第二代：二油酰乙醇胺磷脂+膽固醇膽固醇+軟脂酸軟脂酸 （1）花粉管通道法（）花粉管通道法（pollen-tube pathway） 在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進(jìn)入胚囊所留下的在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進(jìn)入胚囊所留下的通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉(zhuǎn)移方法。通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉(zhuǎn)移方法。（1）受體是整株水平，無須離體培養(yǎng)，突破了宿主范受體是整株水平，無須離體培養(yǎng)，突破了宿主范圍的限制，可應(yīng)用于任何開花植物。圍的限制，可應(yīng)用于任何開花植物。（2 2）轉(zhuǎn)化可用于重組）轉(zhuǎn)化可用于重組dnadna，甚至是總甚至是總dnadna。（3 3）操作技術(shù)條件寬容。操作技術(shù)條件寬容。（4 4）轉(zhuǎn)化率高。）轉(zhuǎn)化率高。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：該法是用外源該法是用外源dna溶液直接來浸種、浸苗、浸穗等手段溶液直接來浸種