蛋白質(zhì)分析的意義

1、蛋白質(zhì)等電聚焦電泳04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )蛋白質(zhì)分析的意義 基礎科學研究 這主要是生命科學研究向分析學家提出的課題。在生命科學研究中，人們需要了解各種蛋白質(zhì)的組成、結構與功能的關系，蛋白質(zhì)的存在形態(tài)以及與小分子，甚至金屬離子的相互作用等等。 食品的鑒定與評價 蛋白質(zhì)是生物體的重要營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品的重要營養(yǎng)指標。測定食品店品中蛋白質(zhì)的含量對指導食品的加工工藝的改革、優(yōu)化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意義。 評價健康、診斷疾病 人體內(nèi)的酸堿平衡，電解質(zhì)平衡，遺傳信息的傳遞，物質(zhì)的代謝和運轉都與蛋白質(zhì)有關。分析意義分析方法 等電點 原理

2、 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )蛋白質(zhì)的分析方法 一類是利用蛋白質(zhì)的共性，如含氮，含肽鍵和折射率等性質(zhì)測量蛋白質(zhì)的含量； 二是利用蛋白質(zhì)中某些特定的氨基酸殘基、芳香基團、酸性和堿性基團等測量蛋白質(zhì)的含量。 我們熟悉的克氏定氮法是第一類分析方法中的一種，而本文要介紹的等電聚焦法屬第二類分析方法。克氏定氮法分析蛋白質(zhì)只可通過測定待測物的總含氮量進而推出蛋白質(zhì)含量，不能分析出所含蛋白質(zhì)種類及各類含量而電泳法正好彌補了這個不足。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈

3、門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )回顧一下等電點的有關知識 設ha為一兩性物質(zhì)，處于等電點時x(h2a+)=x(a-),即所以，ph=1/2(pka1+pka2)=pi(等電點)氨基酸的等電點計算可以參照上述公式。h+2 h+2 +ka1h+ka1ka2=ka1ka2h+2 +ka1h+ka1ka2分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 ) 蛋白質(zhì)是由a氨基酸組成，氨基酸通過肽鏈連接起來成為多肽，長的多肽就被稱為蛋白質(zhì)。氨基酸的種類和序列決定蛋白質(zhì)的性質(zhì)，蛋白質(zhì)末端有-nh3+

4、， -coo- ，側鏈有-nh3+，-coo-，-s-等酸、堿性基團，可見蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，有等電點。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )電泳的原理 溶液中任何物質(zhì)由于其中本身的解離或表面吸附其他帶電質(zhì)點而帶電，帶電顆粒在電場中移動，移動方向取決于它們的帶電符號。電泳技術就是由各種帶電粒子在電場中遷移率不同而進行分離的一種技術。生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，帶電的蛋白質(zhì)分子在電場中會朝著與自己所帶電荷相反方向移動，根據(jù)各種蛋白質(zhì)分子的移動速度不同，對各種蛋白質(zhì)進行

5、分離。 分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 ) 在電場中，速度通常用泳動度來表示。泳動度是帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。即： u=v/e=(d/t)/(v/l)=(d/v)*(l/t) 式中u-泳動度，cm2/(v.s) v-泳動速度，cm/s e-電場強度,v/cm d-顆粒泳動距離，cm l-支持物有效長度，cm v-實際電壓，v t-通電時間，s 通過測量d,l,v,t,即可計算出顆粒的泳動度，而當外界因素一定，泳動度是一物質(zhì)的特性，通過測泳動度，可以鑒別待測物。分析意義分析方

6、法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的基本原理 1分離成為可能： 由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，因而有不同的等電點。當phpi時，蛋白帶負電荷，在電場的作用下向正極移動；不同蛋白質(zhì)的搭配組成差別很大，因此蛋白質(zhì)的等電點范圍很寬。 等電聚焦電泳技術就是在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在正負極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的ph梯度，蛋白質(zhì)在ph梯度凝膠中受電場力作用而泳動。當?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達它的等電點位置，分子所帶凈電荷為0，就不能再遷移。因此蛋白質(zhì)在與其本身pi相等的p

7、h位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。這種效應稱之為“聚焦效應”，保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率 ，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )2等電聚焦中ph梯度的形成： ph梯度的形成依靠有緩沖作用的兩性載體電解質(zhì)，載體電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，其pi分布在2.5到10之間，載體兩性電解質(zhì)溶液的ph大約是該溶液ph范圍的平均值。在沒有電流時，所有載體兩性分子都帶電荷，所帶總的凈電荷為0。 第一步：未通電時，帶電分子無序排列分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁

8、參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )第二步：通過后最先在正極和負極形成ph梯度第三步：穩(wěn)定的ph梯度形成分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 ) 根據(jù)兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，在泳動過程中不斷地與溶液交換質(zhì)子，當達到平衡時，即兩性電解質(zhì)得失質(zhì)子相等，不再出現(xiàn)質(zhì)子交換，載體兩性電解質(zhì)至達等電點并停留在自己的pi區(qū)域 ，pi即是此處的ph值，于是載體電解質(zhì)分離為連續(xù)ph不同的條帶，從而形成連續(xù)的多個ph緩沖區(qū)。由于凝膠的防對流作用，可使ph梯

9、度保持穩(wěn)定不變。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 ) 3蛋白質(zhì)分子分離了 如果把蛋白質(zhì)溶液與載體兩性電解 質(zhì)混合，隨時著ph梯度的形成，蛋白質(zhì) 也將在自己的pi處沉淀下來。這樣蛋白 質(zhì)就被分離開了。再經(jīng)過后續(xù)處理，就 可以對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )4載體兩性物質(zhì)的選擇作為好的兩性電解質(zhì)載體必需符合下列要求:(1).有足夠的緩沖能力，以便能形成p

10、h梯度，而不受蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的影響。(2).在等電點處必需有足夠的電導，以便使一定的電流通過。而且要求各不同pi的載體有相同的電導系數(shù)，使整個體系中的電導均勻。(3).相對分子質(zhì)量要小，以便與被分離的高分子物質(zhì)用分子篩或透析法分開。(4).化學組分不同于被分離物質(zhì)，以免干擾測定。(5).不與被分離物質(zhì)起化學反應，也不會引起被分離物質(zhì)變化。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )5支持ph梯度的介質(zhì)選擇 等電點聚焦電泳的主要條件之一是具有穩(wěn)的ph梯度，以防上對流，避免已分離的物質(zhì)再度混合。支

11、持ph梯度的介質(zhì)有如下兩類(1)密度梯度溶液 密度梯度溶液由一個重溶液和一個輕溶液在梯度混合器中混合而成。最常用的密度梯度溶質(zhì)是蔗糖，因為它對蛋白質(zhì)無害且有保護作用。輕液一般用水。(2)凝膠 等電點聚焦廣泛使用凝膠作為支持ph梯度的介質(zhì)。應用最多的是聚丙烯酰胺凝膠。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )等電點聚焦的顯著優(yōu)點 1.分辨率高2.很稀的樣品都可分離，且重現(xiàn)性好3.可用于測定蛋白質(zhì)或多肽的等電點分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )等電點聚焦的缺點1.要求使用無鹽溶液，而某些蛋白質(zhì)在無鹽溶液中溶解度低，可能產(chǎn)生沉淀；2.樣品中各組分都聚焦到其等電點，對一些在等電點不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用。分析意義分析方法 等電點 原理 一原理 二首頁參考文獻再見了!04級廈門大學化學系(4)班廈 門 大 學 化 學 系 0 4 級 ( 4 班 )參考文獻：郭勇 現(xiàn)代生化技術 科學出版社周先碗 于曉倩 生物化學儀器分析與實驗技術 化學工業(yè)出