儀器分析課件第16章 高效液相色譜法課件

1、第第16章章 高效液相色譜法高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography 16-1 概述概述16-2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀16-3 液固色譜法液固色譜法16-4 液液色譜法液液色譜法16-5 化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法16-6 離子交換色譜法離子交換色譜法16-7 排阻色譜法排阻色譜法16-8 色譜分離方法的選擇色譜分離方法的選擇目目 錄錄16-1 概述概述 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）是）是20 世紀(jì)世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極

2、隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。16-1-1 高效液相色譜法高效液相色譜法 在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。操作。 經(jīng)典液相色譜：經(jīng)典液相色譜：流動(dòng)相常壓輸送，所用固定相柱效流動(dòng)相常壓輸送，所用固定相柱效低，分析周期長。低，分析周期長。 現(xiàn)代液相色譜：現(xiàn)代液相色譜：高壓輸送，柱

3、效大大提高，同時(shí)柱高壓輸送，柱效大大提高，同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。后連有高靈敏度的檢測器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。 高效液相色譜法具有分析速度快，分離效能高，實(shí)高效液相色譜法具有分析速度快，分離效能高，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化等特點(diǎn)。又稱為現(xiàn)了自動(dòng)化等特點(diǎn)。又稱為現(xiàn)代液相色譜法現(xiàn)代液相色譜法、高壓液相高壓液相色譜法色譜法或或高速液相色譜法高速液相色譜法。 和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相兩相-固定相和流動(dòng)相組成。固定相和流動(dòng)相組成。液相色譜的固定液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或

4、在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。；流動(dòng)相是各種溶劑。16-1-2 液相色譜分離原理及分類液相色譜分離原理及分類 被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。小的差異進(jìn)行分離。 色譜分離的實(shí)質(zhì)色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子劑（即流動(dòng)相

5、或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。留行為。 根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合色譜、液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。 它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，色譜的理論，在技術(shù)上在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效速度快、效率高、靈敏度高、操作自

6、動(dòng)化的特點(diǎn)率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：進(jìn)行比較： 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)速最高可達(dá) 103cmmin-1。高

7、效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法：高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法： 例如分離苯的羥基化合物，例如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需個(gè)組分只需1min就可就可完成。完成。 對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱，柱徑徑0.9cm，流動(dòng)相速度為，流動(dòng)相速度為30cm3h-1，需用需用20多小時(shí)才能多小時(shí)才能分離出分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需只需lh之之內(nèi)即可完成。內(nèi)即可完成。 （l）兩者應(yīng)用范圍不同。氣相色譜法）兩者應(yīng)用范圍不同。氣相色譜法分析對(duì)象分析對(duì)象只限只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物于分析氣

8、體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的總數(shù)的20。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80的那些高沸的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。 高效液相色譜法與氣相色譜法：高效液相色譜法與氣相色譜法：（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋海┮合嗌V能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋?氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與

9、固定相相互作用?；プ饔?。而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭奪而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。選擇性。 液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相排阻色譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。色譜并不可能的。 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條

10、件的選擇。一般有利于色譜分離條件的選擇。 （3）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。 （4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際

11、應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。 綜上所述，高效液相色譜法具有綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效高柱效，高選擇性高選擇性，分析速度快分析速度快，靈敏度高靈敏度高，重復(fù)性好重復(fù)性好和和應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。等優(yōu)點(diǎn)。 目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。質(zhì)的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備

12、費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。是它的主要缺點(diǎn)。16-2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖16-2，一般，一般可分為可分為5個(gè)主要部分：個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)。此外還配有。此外還配有輔輔助裝置助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。16-2-1 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)（1）溶劑貯存器）溶劑貯存器（2）高壓輸液泵）高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：主要部件之一，

13、壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 m），液），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。（3）梯度洗脫裝置）梯度洗脫裝置 梯度洗脫就是在分離過程中使用兩種或兩種以上梯度洗脫就是在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比

14、例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH或離子強(qiáng)或離子強(qiáng)度相應(yīng)的變化，以達(dá)到提高分離效果，縮短分析度相應(yīng)的變化，以達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。時(shí)間的目的。外梯度外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。入色譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵一臺(tái)高壓泵, 通過比通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中定的比例抽入高壓泵中混合?；旌稀?梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷的變化流動(dòng)相

15、的強(qiáng)度，梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷的變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合試樣中各組分的來調(diào)整混合試樣中各組分的k值，使所有譜帶都值，使所有譜帶都以最佳平均以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜分離值通過色譜柱。它在液相色譜分離中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過值的變化是通過改變?nèi)軇┑臉O性、改變?nèi)軇┑臉O性、pH和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借助改變溫度來實(shí)現(xiàn)的。是借助改變溫度來實(shí)現(xiàn)的。16-2-2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：通常使

16、用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：16-2-3 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。16-2-4 液相色譜檢測器液相色譜檢測器 作用作用- 用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。成和含量變化的裝置。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶溶質(zhì)性檢測器質(zhì)性檢測器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響

17、應(yīng)，屬于這類檢測器的有應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。等。 另一類是另一類是總體檢測器總體檢測器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。檢測器等。 表表16-116-3 液固色譜法液固色譜法 液液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固

18、定相上的吸附能力的差異來進(jìn)行分離的，質(zhì)在固定相上的吸附能力的差異來進(jìn)行分離的，也稱液固吸附色譜。也稱液固吸附色譜。16-3-1 吸附機(jī)理吸附機(jī)理 當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋１涣鲃?dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ簦ň鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分子）留（就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分子）于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附: Xm + nS

19、ad = Xad + nSm Xm和和Xad分別表示在溶劑中和被吸附的溶質(zhì)分子，分別表示在溶劑中和被吸附的溶質(zhì)分子，Sad和和Sm表示被吸附劑所吸附和在流動(dòng)相中游離的溶劑分子，表示被吸附劑所吸附和在流動(dòng)相中游離的溶劑分子，n表示吸附表示吸附X分子所需要解吸的分子所需要解吸的S分子數(shù)目。分子數(shù)目。 當(dāng)吸附劑對(duì)溶質(zhì)分子的吸附能力大于對(duì)溶劑分子當(dāng)吸附劑對(duì)溶質(zhì)分子的吸附能力大于對(duì)溶劑分子的吸附能力時(shí)，溶質(zhì)分子就吸附在吸附劑上，而的吸附能力時(shí)，溶質(zhì)分子就吸附在吸附劑上，而將溶劑分子脫附；反之，溶質(zhì)分子脫附。將溶劑分子脫附；反之，溶質(zhì)分子脫附。 顯然，溶質(zhì)分子的吸附能愈大，則保留值愈大；顯然，溶質(zhì)分子的吸

20、附能愈大，則保留值愈大；反之，保留值小或不被保留。反之，保留值小或不被保留。 吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和物理化學(xué)性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。物理化學(xué)性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。 組分與吸附劑性質(zhì)近似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；組分與吸附劑性質(zhì)近似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附。適應(yīng)時(shí)，易于吸附。 從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體

21、的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒有選擇性，不能用該法分離相合物。吸附色譜對(duì)同系物沒有選擇性，不能用該法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的同系物。對(duì)分子質(zhì)量不同的同系物。16-3-2 液固色譜固定相液固色譜固定相 固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的就是活性炭。酰胺等。非極性吸附劑最常見的就是活性炭。 極性吸附

22、劑又分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑極性吸附劑又分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧酸和吡咯衍生物。性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧酸和吡咯衍生物。 最常用的是硅膠，其次是氧化鋁。很多薄層色譜和經(jīng)典色最常用的是硅膠，其次是氧化鋁。很多薄層色譜和經(jīng)典色譜是用硅膠進(jìn)行分離的?，F(xiàn)代液相色譜中硅膠不僅作為液譜是用硅膠進(jìn)行分離的?，F(xiàn)代液相色譜中硅膠不僅作為液固

23、吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。表相色譜填料的基體。表16-2。16-3-3 液固色譜流動(dòng)相液固色譜流動(dòng)相液相色譜的流動(dòng)相必須符合下列條件：液相色譜的流動(dòng)相必須符合下列條件：（1）能溶解試樣，但不能與試樣發(fā)生反應(yīng)；）能溶解試樣，但不能與試樣發(fā)生反應(yīng)；（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)；）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)；（3）黏度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效；）黏度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效；（4）應(yīng)與所用檢測器相匹配，例如利用紫外檢測器時(shí)，溶）應(yīng)與所用檢測器相匹配，例如利用紫

24、外檢測器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光；劑要不吸收紫外光；（5）容易精制、純化，毒性小，不易著火，價(jià)格盡量便宜）容易精制、純化，毒性小，不易著火，價(jià)格盡量便宜等。等。 選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。 為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或?yàn)榱双@得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果試樣更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果試樣組分的分配比值范圍很廣，則采用梯度洗脫。組分的分配比值范圍很廣，則采用梯度洗脫。16-3-4 應(yīng)用應(yīng)用 液固色

25、譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中、液固色譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等相對(duì)分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。具有中等相對(duì)分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。 特別適用于分離異構(gòu)體。特別適用于分離異構(gòu)體。16-4 液液色譜法液液色譜法16-4-1 分離原理分離原理 液液色譜又稱液液分配色譜，分離原理基本與液液萃取液液色譜又稱液液分配色譜，分離原理基本與液液萃取相同，都是相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次

26、進(jìn)行，造成各在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。分配系數(shù)小的組分，保留值小，先流出柱。組分。分配系數(shù)小的組分，保留值小，先流出柱。 與氣相色譜不同的是，流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)有較大與氣相色譜不同的是，流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)有較大的影響。的影響。16-4-2 固定相固定相 液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類。下列幾類。（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體） 3040 m的玻璃微

27、球，表面附著一層厚度為的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2 m的多孔硅膠。的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；表面積小，柱容量底；（2）全多孔型載體）全多孔型載體 由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑為由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑為30-50 m的多孔型的多孔型顆粒顆粒（3）全多孔型粒子載體）全多孔型粒子載體 由由nm級(jí)的硅膠粒子堆積而成，又稱堆積硅珠，載體粒級(jí)的硅膠粒子堆積而成，又稱堆積硅珠，載體粒度為度為5-10 m，由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用，由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。最廣泛的一種載體。 由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競爭，因此，由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競爭

28、，因此，對(duì)固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的對(duì)固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。固定液即可解決分離問題。 例如，最常用的例如，最常用的強(qiáng)極性強(qiáng)極性固定液固定液，-氧二丙氧二丙睛，睛，中等極性中等極性的聚乙二醇，的聚乙二醇，非極性非極性的角鯊?fù)榈?。的角鯊?fù)榈取?為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化化學(xué)鍵合固定相學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液

29、相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。16-4-3 流動(dòng)相流動(dòng)相 在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好流動(dòng)相與固定相的

30、極性差別越顯著越好。根。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為為正相分配色譜和反相分配色譜正相分配色譜和反相分配色譜。 如果采用極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)如果采用極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相（相（流動(dòng)相的極性小于固定相的極性），稱為正相分配流動(dòng)相的極性小于固定相的極性），稱為正相分配色譜色譜，它適用于極性化合物的分離。其，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出小的先流出，極性大的后流出。 如果采用非極性物質(zhì)為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相如果采用非極性物質(zhì)為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相（流動(dòng)

31、相的極性大于固定相的極性），稱為反相分配色流動(dòng)相的極性大于固定相的極性），稱為反相分配色譜譜。它適用于非極性化合物的分離，例如適于分離芳烴、。它適用于非極性化合物的分離，例如適于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物，稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物，其流出順序與正相色譜恰好其流出順序與正相色譜恰好相反相反。 16-5 化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡簡稱鍵合相色譜。它是由液相色譜發(fā)展起來的，但因分離稱鍵合相色譜。它是由液相色譜發(fā)展起來的，但因分離機(jī)制和固定相特性方面都與液液色譜涂層有差別，另外機(jī)制和固定相特性方面

32、都與液液色譜涂層有差別，另外也因化學(xué)鍵合相色譜在現(xiàn)代液相色譜中占有重要地位，也因化學(xué)鍵合相色譜在現(xiàn)代液相色譜中占有重要地位，所以一般不宜將化學(xué)鍵合相色譜稱為液液色譜。所以一般不宜將化學(xué)鍵合相色譜稱為液液色譜。 由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子分離容量因子k值范圍寬值范圍寬的樣品。的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。它適用于種類繁多樣品的分離。 根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將

33、鍵合相色根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。 在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小一些，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合小一些，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合相色譜。反相色譜系指非極性鍵合相色譜。16-5-1 化學(xué)鍵合固定相法化學(xué)鍵合固定相法 化學(xué)鍵合固定相一般采用硅膠（薄殼型或全多空化學(xué)鍵合固

34、定相一般采用硅膠（薄殼型或全多空微粒型）為基體，在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)微粒型）為基體，在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化物起反表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為下列四應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為下列四種鍵型：種鍵型：（l）硅酸酯（）硅酸酯（Si一一OR）鍵合固定相）鍵合固定相 它是最先用于液相色譜的鍵合固定相。用醇與它是最先用于液相色譜的鍵合固定相。用醇與硅羥基發(fā)生酯化反應(yīng)：硅羥基發(fā)生酯化反應(yīng)： SiOHROHSiORH2O 由

35、于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性，但這些酯化過的硅膠填具有良好的傳質(zhì)特性，但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相。一般用極性小的溶劑，分離極或醇的流動(dòng)相。一般用極性小的溶劑，分離極性化合物。性化合物。（2）SiC或或Si-N共價(jià)鍵合固定相共價(jià)鍵合固定相 共價(jià)鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸共價(jià)鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制必須限制pH在在48范圍內(nèi)。

36、范圍內(nèi)。（3）硅烷化（）硅烷化（Si-O-Si-C）鍵合固定相）鍵合固定相 這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70以下，以下，pH=29范圍范圍內(nèi)正常工作，是目前應(yīng)用最廣泛的鍵合相。內(nèi)正常工作，是目前應(yīng)用最廣泛的鍵合相。16-5-2 反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠硅膠-C18H37、硅膠、硅膠-苯基苯基等；等；流動(dòng)相是采用極性較流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機(jī)鹽的緩沖水、水和

37、無機(jī)鹽的緩沖溶液溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物； 關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，這種，這種“分子毛分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來分離含有極性官能團(tuán)的當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)：有機(jī)化合物時(shí)： 一方面一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的，分子中

38、的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中； 而而另一方面另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為中的保留行為。 反相色譜應(yīng)用非常廣泛，自反相色譜應(yīng)用非常廣泛，自1976年以來，高效液相色譜分年以來，高效液相色譜分離任務(wù)的離任務(wù)的60%-80%是用反相來完成的。反相色譜具有通是用反相來完成的。反相色譜具有通用型液相色譜的

39、特點(diǎn)。常規(guī)反相色譜技術(shù)，不僅可以分離用型液相色譜的特點(diǎn)。常規(guī)反相色譜技術(shù)，不僅可以分離不同類型的化合物，尤其適于分離同系物，非極性及極性不同類型的化合物，尤其適于分離同系物，非極性及極性較弱的化合物，例如多環(huán)芳烴等低極性化合物。控制離子較弱的化合物，例如多環(huán)芳烴等低極性化合物?？刂齐x子化技術(shù)，用流動(dòng)相加入緩沖溶液或改變化技術(shù)，用流動(dòng)相加入緩沖溶液或改變pH的方法，分離的方法，分離不離子化或弱離子化的體系。不離子化或弱離子化的體系。16-5-3 正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法 此法是此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2、雙羥基等、雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相鍵合在硅膠表

40、面，作為固定相；而以非極性或極；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動(dòng)相，分離極性化（如氯仿、醇、乙腈等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。合物。 此時(shí)，此時(shí)，組分的分配比組分的分配比 k 值隨其極性的增加而值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。16-5-4 離子性鍵合相色譜法離子性鍵合相色譜法 當(dāng)以薄殼型或全

41、多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如合各種離子交換基團(tuán)，如-SO3H ，-CH2NH2、COOH、-CH2N（CH3）等時(shí)，就形成了離子性）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。其分離原理與離子交換色譜類同?；瘜W(xué)鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)： 適用于分離所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合適用于分離所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面

42、上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動(dòng)相的大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動(dòng)相的組成和種類來有效的分離非極性、極性和離子型化合物。組成和種類來有效的分離非極性、極性和離子型化合物。 由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，不僅解決了由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。 鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。很好的化學(xué)穩(wěn)定性和

43、熱穩(wěn)定性。 這類固定相柱效高，使用周期長，分析重現(xiàn)性好。這類固定相柱效高，使用周期長，分析重現(xiàn)性好。16-6 離子交換色譜法（離子交換色譜法（IEC） 離子交換色譜法是利用不同離子交換色譜法是利用不同待測離子待測離子對(duì)固定相對(duì)固定相親和親和力的差別力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。來實(shí)現(xiàn)分離的。 其固定相采用其固定相采用離子交換樹脂離子交換樹脂，樹脂上分布有，樹脂上分布有固定的帶固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。16-6-1 分離原理分離原理 當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，衡離子進(jìn)行可逆交換，

44、 其交換反應(yīng)通式如下：其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換陽離子交換：R-SO3H +M+ = R-SO3 M + H + 陰離子交換陰離子交換：R-NR4OH +X- = R-NR4 X + OH- 平衡常數(shù)平衡常數(shù)K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強(qiáng)。由于不同的物質(zhì)在溶劑中解離后，對(duì)離子交相互作用越強(qiáng)。由于不同的物質(zhì)在溶劑中解離后，對(duì)離子交換中心具有不同的親和力，因此，具有不同的平衡常數(shù)。親換中心具有不同的親和力，因此，具有不同的平衡常數(shù)。親和力大的，在柱中的停留時(shí)間長，具有高的保留值。和力大的，在柱中的停留時(shí)間長，具有高的保留值。16-6-

45、2 固定相固定相 常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種型式，分為三種型式， 一是常見的純離子交換樹脂；一是常見的純離子交換樹脂； 二是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離二是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹脂，具有很高的柱效，但柱容量不大；子交換樹脂，具有很高的柱效，但柱容量不大； 三是大孔徑網(wǎng)絡(luò)樹脂，適用于非水溶液中物質(zhì)的分離，因三是大孔徑網(wǎng)絡(luò)樹脂，適用于非水溶液中物質(zhì)的分離，因?yàn)樗鼈兊目讖胶蛢?nèi)表面積大，不需要溶脹，便可滿意地使為它們的孔徑和內(nèi)表面積大，不需要溶脹，便可滿意地使用。用。 按

46、結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。和陰離子交換樹脂。 陽離子交換樹脂具有與試樣中陽離子交換的基團(tuán)，又可分陽離子交換樹脂具有與試樣中陽離子交換的基團(tuán)，又可分為強(qiáng)酸性和弱酸性樹脂。為強(qiáng)酸性和弱酸性樹脂。 陰離子交換樹脂具有與試樣中陰離子可交換的基團(tuán)，又可陰離子交換樹脂具有與試樣中陰離子可交換的基團(tuán)，又可分為強(qiáng)堿性和弱堿性。分為強(qiáng)堿性和弱堿性。 表表16-6.16-6-3 流動(dòng)相流動(dòng)相 最常用的是水緩沖溶液，有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如最常用的是水緩沖溶液，有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特甲醇，或

47、乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，并改善試樣的溶解度。殊的選擇性，并改善試樣的溶解度。 所用的緩沖溶液，通常由下列化合物配制：鈉、所用的緩沖溶液，通常由下列化合物配制：鈉、鉀、銨的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應(yīng)的鉀、銨的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應(yīng)的酸混合成酸性緩沖溶液或氫氧化鈉混合成堿性緩酸混合成酸性緩沖溶液或氫氧化鈉混合成堿性緩沖溶液等。沖溶液等。16-6-4 應(yīng)用應(yīng)用 主要是用來分離離子或可解離的化合物。它不僅主要是用來分離離子或可解離的化合物。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物

48、大分子。分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。16-7 排阻色譜法排阻色譜法16-7-1 分離原理分離原理 亦稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法。是一亦稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法。是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的技術(shù)。主要用種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的技術(shù)。主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。的。 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的尺寸排阻色譜是按分子大小順

49、序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)-凝凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。最后洗出色譜柱。 這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。后由柱中流出。16-7-2 排阻色譜的

50、填料和流動(dòng)相排阻色譜的填料和流動(dòng)相 根據(jù)填料的來源可分為有機(jī)和無機(jī)填料。根據(jù)填料的來源可分為有機(jī)和無機(jī)填料。 有機(jī)填料如交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，是目前使用最多的一種有機(jī)填料如交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，是目前使用最多的一種填料，滲透性好，柱效高，但不宜長期在高溫條件下使填料，滲透性好，柱效高，但不宜長期在高溫條件下使用。用。 硅膠、多孔玻璃等無機(jī)填料，耐高溫、機(jī)械性能穩(wěn)定，硅膠、多孔玻璃等無機(jī)填料，耐高溫、機(jī)械性能穩(wěn)定，但它們的共同缺點(diǎn)是其表面的吸附物性，由于表面的剩但它們的共同缺點(diǎn)是其表面的吸附物性，由于表面的剩余羥基產(chǎn)生的活性中心，對(duì)一些極性物質(zhì)有吸附作用，余羥基產(chǎn)生的活性中心，對(duì)一些極性物質(zhì)有吸附作用，因而擾亂了排阻色譜分離的機(jī)理，這就要求完全的化學(xué)因而擾亂了排阻色譜分離的機(jī)理，這就要求完全的化學(xué)硅烷化處理，以消除表面殘留羥基的影響。硅烷化處理，以消除表面殘留羥基的影響。 在排阻色譜中使用的流動(dòng)相，僅僅作為試樣的載體而不應(yīng)