關(guān)于最低檢測限與線性范圍試驗(yàn)的討論

1、 第二次實(shí)驗(yàn)第二次實(shí)驗(yàn) 血清總蛋白測定、血清總蛋白測定、 最低檢出限最低檢出限 線性范圍試驗(yàn)線性范圍試驗(yàn)教學(xué)要求與目的教學(xué)要求與目的1 1. .掌握血清總蛋白測定原理和測定方掌握血清總蛋白測定原理和測定方 法，了解其臨床意義。法，了解其臨床意義。2.2.掌握最低檢出限、線性范圍的定義、掌握最低檢出限、線性范圍的定義、 評價方法及用途。評價方法及用途。3.3.熟悉最低檢出限、線性范圍的實(shí)驗(yàn)熟悉最低檢出限、線性范圍的實(shí)驗(yàn) 方法。方法。教學(xué)內(nèi)容教學(xué)內(nèi)容1.1.雙縮脲法測定血清總蛋白。雙縮脲法測定血清總蛋白。2.2.最低檢出限測定。最低檢出限測定。3.3.線性范圍試驗(yàn)。線性范圍試驗(yàn)。一、血清總蛋白測定

2、一、血清總蛋白測定凱氏定氮法凱氏定氮法 參考方法參考方法 雙縮脲法雙縮脲法 常規(guī)方法常規(guī)方法酚試劑法酚試劑法染料結(jié)合法染料結(jié)合法濁度法、紫外光譜法濁度法、紫外光譜法 （一）實(shí)驗(yàn)原理（一）實(shí)驗(yàn)原理 血清中蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性溶液血清中蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性溶液中能與中能與Cu2+作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物，此反應(yīng)和兩個尿素分子縮合后生成物，此反應(yīng)和兩個尿素分子縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與銅離子作用形的雙縮脲在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)相似，故稱成紫紅色的反應(yīng)相似，故稱雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)。 在在540nm波長處有吸收峰，在一波長處有吸收峰，在一定濃度

3、范圍內(nèi)其吸光度增加與蛋白含定濃度范圍內(nèi)其吸光度增加與蛋白含量成正比，由此可求得蛋白質(zhì)含量。量成正比，由此可求得蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) + + OHCu2+紫紅色絡(luò)合物紫紅色絡(luò)合物（二）實(shí)驗(yàn)試劑（二）實(shí)驗(yàn)試劑 1、雙縮脲試劑、雙縮脲試劑 氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉 硫酸銅、碘化鉀硫酸銅、碘化鉀 2、標(biāo)準(zhǔn)液總蛋白、標(biāo)準(zhǔn)液總蛋白50g/L （三）操作方法（三）操作方法 1、操作參數(shù)：、操作參數(shù)： 波長：波長：540nm溫度：溫度：37 測定模式：終點(diǎn)法測定模式：終點(diǎn)法 2.操作步驟操作步驟（ul）BSUDH2O20標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液20血清血清20雙縮脲試劑雙縮脲試劑 1000100010

4、00混勻，混勻，37水浴水浴10分鐘，在分鐘，在540nm波波長處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光長處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。度。3、計算、計算血清總蛋白血清總蛋白(g/L)=測定管吸光度測定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度（50g/L）參考值參考值：6083g/L（四）注意事項（四）注意事項 嚴(yán)重溶血和黃疸可使測定結(jié)果偏高嚴(yán)重溶血和黃疸可使測定結(jié)果偏高,可可作標(biāo)本空白管消除。作標(biāo)本空白管消除。2.脂肪乳糜干擾比色，可加丙酮離心。脂肪乳糜干擾比色，可加丙酮離心。3.右旋糖酐可使測定產(chǎn)生混濁影響結(jié)果。右旋糖酐可使測定產(chǎn)生混濁影響結(jié)果。 1.精密度較好、準(zhǔn)確度較高，

5、精密度較好、準(zhǔn)確度較高，WHO 推薦方法。推薦方法。2.線性范圍寬（線性范圍寬（10-120g/L）。）。3.操作簡便你、快速，成本低廉。操作簡便你、快速，成本低廉。4.靈敏度較低靈敏度較低。 （五）方法學(xué)評價（五）方法學(xué)評價 （六）臨床意義（六）臨床意義 1.蛋白濃度升高蛋白濃度升高（1）血液濃縮：脫水、外傷性休克等。）血液濃縮：脫水、外傷性休克等。（2）蛋白質(zhì)合成增加：多發(fā)性骨髓瘤、）蛋白質(zhì)合成增加：多發(fā)性骨髓瘤、免疫增殖病等。免疫增殖病等。（3）蛋白質(zhì)合成障礙：如肝臟疾病。）蛋白質(zhì)合成障礙：如肝臟疾病。（1）蛋白丟失：如腎病綜合征。）蛋白丟失：如腎病綜合征。 2.蛋白濃度降低蛋白濃度降低

6、（2）攝入不足：營養(yǎng)不良。）攝入不足：營養(yǎng)不良。 二、最低檢測限試驗(yàn)二、最低檢測限試驗(yàn)檢測限（檢測限（LoD）：）：是檢測系統(tǒng)可檢測出是檢測系統(tǒng)可檢測出的最低分析物濃度。的最低分析物濃度。 最低檢測限（最低檢測限（LLD）：指當(dāng)標(biāo)本中）：指當(dāng)標(biāo)本中不含有待測分析物時，反應(yīng)響應(yīng)量可不含有待測分析物時，反應(yīng)響應(yīng)量可能出現(xiàn)的數(shù)值范圍，即單次測量可達(dá)能出現(xiàn)的數(shù)值范圍，即單次測量可達(dá)到的非空白檢測響應(yīng)量對應(yīng)的分析物到的非空白檢測響應(yīng)量對應(yīng)的分析物量。量。 功能靈敏度（功能靈敏度（FS）：以日間重復(fù)）：以日間重復(fù)CV為為20%時對應(yīng)檢測限樣品具有的平均濃時對應(yīng)檢測限樣品具有的平均濃度確定為檢測系統(tǒng)或方法可

7、定量報告的度確定為檢測系統(tǒng)或方法可定量報告的分析物的最低濃度或其它量值分析物的最低濃度或其它量值 。（一）原理（一）原理 選擇合適的空白標(biāo)本，該標(biāo)本與待測選擇合適的空白標(biāo)本，該標(biāo)本與待測標(biāo)本的區(qū)別在于不含有待測物質(zhì)，一般標(biāo)本的區(qū)別在于不含有待測物質(zhì)，一般用處理過的標(biāo)本或一般標(biāo)本，在分析步用處理過的標(biāo)本或一般標(biāo)本，在分析步驟中省去關(guān)鍵試劑或操作。驟中省去關(guān)鍵試劑或操作。本次實(shí)驗(yàn)采用蒸餾水作為空白標(biāo)本，采本次實(shí)驗(yàn)采用蒸餾水作為空白標(biāo)本，采用雙縮脲法進(jìn)行多次測定，求出吸光度用雙縮脲法進(jìn)行多次測定，求出吸光度的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計算最低檢測限。的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計算最低檢測限。（二）操作步驟二）操作步驟（u

8、l）BSU（1-10）DH2O20標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液20雙縮脲試劑雙縮脲試劑 100010001000 混勻，混勻，37水浴水浴10分鐘，在分鐘，在540nm波長處，波長處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。（三）計算（三）計算 1.計算計算10次測定的平均吸光度及標(biāo)準(zhǔn)差。次測定的平均吸光度及標(biāo)準(zhǔn)差。 2.計算最低檢測限：平均吸光度計算最低檢測限：平均吸光度+3S 3.將吸光度值轉(zhuǎn)換成濃度單位。將吸光度值轉(zhuǎn)換成濃度單位。 LLD=A低低/A標(biāo)標(biāo)C標(biāo)標(biāo)三、線性范圍試驗(yàn)三、線性范圍試驗(yàn)可報告范圍（可報告范圍（RR）：指可以報告的所有）：指可以報告的所有結(jié)果的范圍，包含兩種類型的

9、范圍，即結(jié)果的范圍，包含兩種類型的范圍，即分析測量范圍和臨床可報告范圍。分析測量范圍和臨床可報告范圍。 分析測量范圍（分析測量范圍（AMR）：指分析樣）：指分析樣本未經(jīng)任何預(yù)處理（稀釋、濃縮等），本未經(jīng)任何預(yù)處理（稀釋、濃縮等），由檢測系統(tǒng)直接測量得到的待測物的可由檢測系統(tǒng)直接測量得到的待測物的可靠結(jié)果范圍，在此范圍內(nèi)一系列不同濃靠結(jié)果范圍，在此范圍內(nèi)一系列不同濃度的樣本分析物的測量值與其實(shí)際濃度度的樣本分析物的測量值與其實(shí)際濃度（真值）呈線性比例關(guān)系。（真值）呈線性比例關(guān)系。 臨床可報告范圍（臨床可報告范圍（CRR）：指定量）：指定量檢測項目向臨床能報告的檢測范圍，患檢測項目向臨床能報告的檢

10、測范圍，患者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其它預(yù)處理。者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其它預(yù)處理。（一）原理（一）原理 線性范圍是指系統(tǒng)最終輸出值（濃度線性范圍是指系統(tǒng)最終輸出值（濃度或活性）與被分析物濃度或活性成比例或活性）與被分析物濃度或活性成比例的范圍。線性范圍的測定即測定濃度曲的范圍。線性范圍的測定即測定濃度曲線接近直線的程度，它反映整個系統(tǒng)的線接近直線的程度，它反映整個系統(tǒng)的輸出特征。輸出特征。 本試驗(yàn)使用不同濃度的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶本試驗(yàn)使用不同濃度的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用雙縮脲試劑測定各自的濃度，以液，用雙縮脲試劑測定各自的濃度，以標(biāo)準(zhǔn)液預(yù)期濃度為橫坐標(biāo)，測得濃度為標(biāo)準(zhǔn)液預(yù)期濃度為橫坐標(biāo)，測得濃度為縱坐標(biāo)，在

11、坐標(biāo)紙上作圖，即可繪制出縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，即可繪制出一條直線，即計量反應(yīng)曲線。一條直線，即計量反應(yīng)曲線。（二）試劑（二）試劑 1.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（50g/L） 2.混合血清（混合血清（120g/L） 3.雙縮脲試劑雙縮脲試劑1.1.制備不同濃度的樣本制備不同濃度的樣本U1U2U3U4U5U6U7DH2O（ul）200200200200200200血清（血清（ul）300300300300300300濃度（濃度（g/L)5.69.315.625.9 43.2 72.0 120.02.2.按下表操作按下表操作（ul）BSU1U2U3U4.U7DH2O20標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液20血清血清2

12、0202020試劑試劑100010001000100010001000 各測定管均測定雙份，混勻，各測定管均測定雙份，混勻，37水浴水浴10分鐘，在分鐘，在540nm波長處，用空白波長處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。管調(diào)零，讀取各管吸光度。（四）記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，（四）記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并繪制劑量反應(yīng)并繪制劑量反應(yīng)曲線。以總蛋白濃度預(yù)期值為橫坐標(biāo)，曲線。以總蛋白濃度預(yù)期值為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制曲線，測定值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制曲線，即為劑量反應(yīng)曲線。即為劑量反應(yīng)曲線。 （五）評價（五）評價 1.1.目測法：是評估幾個不同濃度樣本目測法：是評估幾個不同濃度樣本的多次測量均值與實(shí)際值

13、之間是否具有的多次測量均值與實(shí)際值之間是否具有肉眼上的直線關(guān)系。沒有用到統(tǒng)計學(xué)方肉眼上的直線關(guān)系。沒有用到統(tǒng)計學(xué)方法來驗(yàn)證線性。法來驗(yàn)證線性。 2.2.平均斜率法：是采用最小二乘法直線平均斜率法：是采用最小二乘法直線回歸作統(tǒng)計分析方法。以總蛋白濃度預(yù)回歸作統(tǒng)計分析方法。以總蛋白濃度預(yù)期值為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)，在坐期值為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，若所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在坐標(biāo)紙上標(biāo)紙上作圖，若所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在坐標(biāo)紙上呈明顯直線趨勢，呈明顯直線趨勢，建立回歸方程建立回歸方程y=a+bx，要求，要求a接近于接近于0，b在在0.971.03之間，若滿足此條件，則可之間，若滿足此條件，則可直接判斷該測定方法是否在所要求的線直接判斷該測定方法是否在所要求的線性范圍。性范圍。 若若a較大，較大，b1.03或或0.97則認(rèn)為在高濃則認(rèn)為在高濃度或低濃度處的實(shí)測值和預(yù)期值間有較度或低濃度處的實(shí)測值和預(yù)期值間有較大偏差。試著舍去某組數(shù)據(jù)，另作回歸大偏差。試著舍去某