第八章抗生素藥物的分析

1、第八章 抗生素藥物的分析第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述抗生素的概念：抗生素的概念：具有抑制或殺滅微生物的一類(lèi)物質(zhì)。具有抑制或殺滅微生物的一類(lèi)物質(zhì)?？股氐奶卣鳎嚎股氐奶卣鳎荷矬w在生命活動(dòng)過(guò)程中合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。生物體在生命活動(dòng)過(guò)程中合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解、聚合性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解、聚合純度一般較低純度一般較低臨床上會(huì)引起不良反應(yīng)臨床上會(huì)引起不良反應(yīng)臨床應(yīng)用廣泛，影響大臨床應(yīng)用廣泛，影響大抗生素藥品質(zhì)量研究的項(xiàng)目：抗生素藥品質(zhì)量研究的項(xiàng)目：性狀及鑒別試驗(yàn)，含量測(cè)定或效價(jià)測(cè)定，酸堿度性狀及鑒別試驗(yàn)，含量測(cè)定或效價(jià)測(cè)定，酸堿度測(cè)定，澄明度，水分或干燥失重，安全試驗(yàn)測(cè)定，澄明度，水分或干

2、燥失重，安全試驗(yàn)（異常毒性），熱原，降壓物質(zhì)，無(wú)菌。（異常毒性），熱原，降壓物質(zhì)，無(wú)菌。其他檢查：組分、雜質(zhì)、晶型、比旋度、灰分、其他檢查：組分、雜質(zhì)、晶型、比旋度、灰分、重金屬、熔點(diǎn)等。重金屬、熔點(diǎn)等?？股厮幤贩治龀Ｓ玫姆椒ǎ嚎股厮幤贩治龀Ｓ玫姆椒ǎ何锢矸椒ㄎ锢矸椒? :旋光法、紫外、紅外、色譜等旋光法、紫外、紅外、色譜等化學(xué)方法（專(zhuān)屬性不強(qiáng)）：功能團(tuán)反應(yīng)，鑒別和化學(xué)方法（專(zhuān)屬性不強(qiáng)）：功能團(tuán)反應(yīng)，鑒別和含量的測(cè)定。容量分析法：酸堿滴定（青霉素含量的測(cè)定。容量分析法：酸堿滴定（青霉素含量測(cè)定）和碘量法。含量測(cè)定）和碘量法。生物學(xué)方法：酶反應(yīng)、微生物法測(cè)定效價(jià)生物學(xué)方法：酶反應(yīng)、微生物法測(cè)

3、定效價(jià)第二節(jié)第二節(jié) 抗生素效價(jià)微生物檢定法抗生素效價(jià)微生物檢定法 一、微生物檢定法定義：一、微生物檢定法定義： 是利用微生物發(fā)育時(shí)對(duì)某些物質(zhì)的特殊依賴(lài)是利用微生物發(fā)育時(shí)對(duì)某些物質(zhì)的特殊依賴(lài)性，按這些物質(zhì)對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，對(duì)他們作性，按這些物質(zhì)對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，對(duì)他們作出定量鑒定的方法。微生物檢定法可分為三類(lèi)：出定量鑒定的方法。微生物檢定法可分為三類(lèi)：稀釋法（稀釋法（dilute methoddilute method）、比濁法）、比濁法 （turbid turbid compare methodcompare method）、瓊脂擴(kuò)散法（）、瓊脂擴(kuò)散法（diffuse diffuse me

4、thodmethod）。與化學(xué)方法相比：與化學(xué)方法相比：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1、原理與醫(yī)療要求基本一致、原理與醫(yī)療要求基本一致 2 2、對(duì)微生物作用直接反映其抗菌活性、對(duì)微生物作用直接反映其抗菌活性缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1 1、結(jié)果是總效價(jià)，無(wú)法區(qū)分多組分、結(jié)果是總效價(jià)，無(wú)法區(qū)分多組分 2 2、時(shí)間長(zhǎng)，有一定誤差，操作繁雜、時(shí)間長(zhǎng)，有一定誤差，操作繁雜二、抗生素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)（二、抗生素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)（potency)potency)單位單位牛津單位牛津單位: :抑制抑制5050毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的青霉素的最低含量為一個(gè)牛津單位菌生長(zhǎng)的青霉素的最低含量為一個(gè)牛津單位. .一個(gè)

5、牛津單位相當(dāng)于一個(gè)牛津單位相當(dāng)于0.6ug0.6ug的青霉素鈉鹽所具有的的青霉素鈉鹽所具有的抗生活力，抗生活力，1mg1mg青霉素青霉素g g鈉鹽含有鈉鹽含有16671667個(gè)牛津單個(gè)牛津單位位,(iu),(iu)（一）（一）稀釋單位稀釋單位 (u/ml(u/ml，u/mg)u/mg)將將1mg1mg抗生素配成溶液，在一定條件下進(jìn)行稀釋?zhuān)股嘏涑扇芤?，在一定條件下進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢?duì)某一細(xì)菌能抑制其生長(zhǎng)的最高稀釋度，即為對(duì)某一細(xì)菌能抑制其生長(zhǎng)的最高稀釋度，即為1mg1mg抗生素中可含有的單位?？股刂锌珊械膯挝?。（二）（二）重量單位重量單位 (u/mg)(u/mg) 以抗生物有效成分（即生理活性部

6、分）以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作為抗生素的單位。稱(chēng)重量單位的重量作為抗生素的單位。稱(chēng)重量單位. .。如一個(gè)鏈霉素堿單位的重量為如一個(gè)鏈霉素堿單位的重量為1 1微克，一微克，一個(gè)青霉素個(gè)青霉素g g鈉鹽的單位的重量為鈉鹽的單位的重量為0.60.6微克。微克。同一種抗生素的各種鹽的校價(jià)可根據(jù)其同一種抗生素的各種鹽的校價(jià)可根據(jù)其分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類(lèi)進(jìn)行換算而得。分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類(lèi)進(jìn)行換算而得。青霉素g鉀鹽的理論效價(jià)（u/mg）=鉀鹽的分子量青霉素鈉鹽的分子量青霉素鈉鹽的理論效價(jià)青霉素ggg159348.37237.3561667（u/mg）1 1類(lèi)似重量單位類(lèi)似重量單位: : 以抗生素鹽類(lèi)純

7、品的重量為單位。包括無(wú)生以抗生素鹽類(lèi)純品的重量為單位。包括無(wú)生物活性的酸根和金屬離子。物活性的酸根和金屬離子。2 2重量折算單位重量折算單位 以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙?shí)際以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙?shí)際重量為一個(gè)單位，重量為一個(gè)單位，3 3特定單位特定單位 以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個(gè)以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個(gè)單位，經(jīng)有關(guān)國(guó)家權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可而定單位，經(jīng)有關(guān)國(guó)家權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可而定. .效價(jià)測(cè)定的方法：效價(jià)測(cè)定的方法：一、稀釋法（一、稀釋法（dilute method）二、比濁法二、比濁法 （turbid compare method）三、瓊脂擴(kuò)散法（三、瓊脂擴(kuò)散法（

8、diffuse method） 一、稀釋法一、稀釋法 原理：用液體培養(yǎng)基逐級(jí)將抗生素稀釋?zhuān)恚河靡后w培養(yǎng)基逐級(jí)將抗生素稀釋?zhuān)诟鞴苤屑尤氲攘康脑囼?yàn)菌液，進(jìn)行培養(yǎng)，在各管中加入等量的試驗(yàn)菌液，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度，再觀察抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度，再與同法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品終點(diǎn)作比較，從而求與同法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品終點(diǎn)作比較，從而求得被測(cè)抗生素的效價(jià)。得被測(cè)抗生素的效價(jià)。nx=(t/s)x=(t/s)* *c cnx x樣品效價(jià)樣品效價(jià)(u/ml)(u/ml)nt t檢品液最大稀釋倍數(shù)檢品液最大稀釋倍數(shù)ns s標(biāo)準(zhǔn)品液最大稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品液最大稀釋倍數(shù)nc c標(biāo)準(zhǔn)品液效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品液效價(jià)

9、(u/ml)(u/ml)試管編號(hào)試管編號(hào)1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品供試品供試品2 2- - -4 4- - -8 8- - -1616- - -3232- -+ +6464+ + +128128+ + +256256+ + +512512+ + +10241024+ + +-：細(xì)菌被抑制 +：細(xì)菌生長(zhǎng)x=(t/s)x=(t/s)* *c=c=（16/3216/32）* *40=20 40=20 （u/ml)u/ml)檢測(cè)終點(diǎn)判斷：檢測(cè)終點(diǎn)判斷：1、試驗(yàn)菌生長(zhǎng)完全抑制、試驗(yàn)菌生長(zhǎng)完全抑制2、生長(zhǎng)、生長(zhǎng)50%抑制抑制3、指示劑變色、指

10、示劑變色4、電位差的改變、電位差的改變5、菌種的溶血現(xiàn)象等、菌種的溶血現(xiàn)象等二、比濁法二、比濁法 原理：將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)原理：將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)（約培養(yǎng)（約3-4h3-4h），測(cè)量培養(yǎng)基濁度，其濁），測(cè)量培養(yǎng)基濁度，其濁度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系，度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系，在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。 細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直接受抗生素效細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直接受抗生素效價(jià)的影響。價(jià)的影響。影響因素：影響因素：一、影響比濁法的物理因素一、影響

11、比濁法的物理因素 1 1、散射現(xiàn)象、散射現(xiàn)象 2 2、菌液濃度：、菌液濃度： 3 3、細(xì)菌體大小的變化、細(xì)菌體大小的變化二、培養(yǎng)基：在沒(méi)有外加抑制劑的情況下，二、培養(yǎng)基：在沒(méi)有外加抑制劑的情況下，菌體的生長(zhǎng)受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng)菌體的生長(zhǎng)受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng)溫度、通氣等條件影響。一般的試驗(yàn)菌是溫度、通氣等條件影響。一般的試驗(yàn)菌是金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，phph在在6.8-7.86.8-7.8。三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時(shí)間三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時(shí)間3 3小小時(shí)，可縮短為時(shí)，可縮短為2 2小時(shí)。小時(shí)。操作流程如圖：操作流程如圖：基本要點(diǎn)：基本要點(diǎn)：1 1 培養(yǎng)條件的

12、控制：試管規(guī)格均一培養(yǎng)條件的控制：試管規(guī)格均一 水浴水浴箱水溫均勻，試管按拉丁方排列。箱水溫均勻，試管按拉丁方排列。2 2 細(xì)菌生長(zhǎng)誤差的控制：細(xì)菌生長(zhǎng)誤差的控制：3 3 測(cè)量時(shí)間的控制：各管應(yīng)先充分混勻，測(cè)量時(shí)間的控制：各管應(yīng)先充分混勻，將菌液移入比色皿后靜止將菌液移入比色皿后靜止2 2分鐘后測(cè)定。分鐘后測(cè)定。三、瓊脂擴(kuò)散法（三、瓊脂擴(kuò)散法（diffuse method） 即管碟法即管碟法n管碟法原理管碟法原理:n 抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，通過(guò)透一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，通過(guò)透明

13、培養(yǎng)基觀察抑菌圈，抗生素劑量的對(duì)數(shù)與抑菌圈面明培養(yǎng)基觀察抑菌圈，抗生素劑量的對(duì)數(shù)與抑菌圈面積或直徑成正比。在同樣條件下將已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品積或直徑成正比。在同樣條件下將已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價(jià)的供試品溶液的劑量反應(yīng)溶液與未知效價(jià)的供試品溶液的劑量反應(yīng)(抑菌圈抑菌圈)進(jìn)進(jìn)行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液對(duì)一定試驗(yàn)菌所得的時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液對(duì)一定試驗(yàn)菌所得的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計(jì)為一劑量法、二劑量法及三劑量法。以上原

14、理，可設(shè)計(jì)為一劑量法、二劑量法及三劑量法。從而可以較為準(zhǔn)確地測(cè)定供試品的效價(jià)。從而可以較為準(zhǔn)確地測(cè)定供試品的效價(jià)。抑菌圈的形成抑菌圈的形成 nm:抗生素在管中的量抗生素在管中的量nd：擴(kuò)散系數(shù)：擴(kuò)散系數(shù)nt：擴(kuò)散時(shí)間：擴(kuò)散時(shí)間nc：最低抑菌濃度：最低抑菌濃度nh：培養(yǎng)基厚度：培養(yǎng)基厚度)4log)21. 9/1 (log2dthcrdtmd的影響因素：的影響因素：抗生素本身結(jié)構(gòu)、分子量等，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單者容易擴(kuò)抗生素本身結(jié)構(gòu)、分子量等，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單者容易擴(kuò)散，分子量大的擴(kuò)散就慢，散，分子量大的擴(kuò)散就慢，雜質(zhì)：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也雜質(zhì)：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也有擴(kuò)散系統(tǒng)，看干擾

15、抗生素的擴(kuò)散，影響抑菌圈有擴(kuò)散系統(tǒng)，看干擾抗生素的擴(kuò)散，影響抑菌圈的大小和清晰度。的大小和清晰度。瓊脂含量：含量過(guò)多影響抗生素的擴(kuò)散，過(guò)少又瓊脂含量：含量過(guò)多影響抗生素的擴(kuò)散，過(guò)少又使鋼管下陷，影響抑菌圈的大小。使鋼管下陷，影響抑菌圈的大小。菌種對(duì)抗生素的吸附作用：菌種對(duì)抗生素的吸附作用：ph影響分子的形式、影響分子的形式、溫度影響擴(kuò)散溫度影響擴(kuò)散d增大，增大，r也增大也增大)4log(log21. 92dthcmdtrnt的影響：的影響：n 一般一般t增加，增加，r增大，但時(shí)間太長(zhǎng)影響抑菌圈增大，但時(shí)間太長(zhǎng)影響抑菌圈清晰度。清晰度。nm的影響：在一定的范圍內(nèi)，小管內(nèi)的影響：在一定的范圍內(nèi)，小

16、管內(nèi)m越大，越大，抑菌圈直徑越大，抑菌圈直徑越大，m還與抗生素的抗菌活性、還與抗生素的抗菌活性、濃度、鋼管的大小、劑型、輔料等有關(guān)。濃度、鋼管的大小、劑型、輔料等有關(guān)。nc的影響：的影響：c越小，抑菌圈直徑越大，越小，抑菌圈直徑越大，c與菌種、與菌種、菌量、培養(yǎng)菌量、培養(yǎng)基、溫度等有關(guān)基、溫度等有關(guān)nh的影響：培養(yǎng)基增厚，則抑菌圈減小。的影響：培養(yǎng)基增厚，則抑菌圈減小。n操作中要注意：操作中要注意：n1試驗(yàn)菌種：挑選合適的敏感菌；用適宜試驗(yàn)菌種：挑選合適的敏感菌；用適宜的菌種保存方法；定期對(duì)菌種分離純化；的菌種保存方法；定期對(duì)菌種分離純化；控制菌齡菌量。控制菌齡菌量。n2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的成分影

17、響抑菌圈的大培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的成分影響抑菌圈的大小和清晰度，小和清晰度，ph也很重要。也很重要。一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）n一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）原理：在一定一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）原理：在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑隨抗生素濃度的范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑隨抗生素濃度的增減而增減。并且抑菌圈的直徑與抗生增減而增減。并且抑菌圈的直徑與抗生素的對(duì)數(shù)劑量成線性關(guān)系。據(jù)此測(cè)定抗素的對(duì)數(shù)劑量成線性關(guān)系。據(jù)此測(cè)定抗生素效價(jià)。生素效價(jià)。 y=a+bxy=a+bxy:y:抑菌圈直徑抑菌圈直徑a a：截距：截距b b：斜率：斜率x x：抗生素濃度的對(duì)數(shù)。：抗生素濃度的對(duì)數(shù)。 方法：為了消除平板間的差異，在

18、每一平板的含菌方法：為了消除平板間的差異，在每一平板的含菌培養(yǎng)基上放置培養(yǎng)基上放置6 6個(gè)小鋼管，相間的個(gè)小鋼管，相間的3 3個(gè)小管內(nèi)加入個(gè)小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的某一濃度（抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的某一濃度（ckck）, , 他所產(chǎn)生的抑他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為菌圈直徑平均值為 ，另外，另外3 3個(gè)小管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品個(gè)小管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度（的中心濃度（coco）, ,他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為為 。 令令f fk k = =這樣采用自身對(duì)照的方法，可以消除平板間的誤差，這樣采用自身對(duì)照的方法，可以消除平板間的誤差，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。使結(jié)果更加準(zhǔn)確。f= a+bxf= a

19、+bx標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：做標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：做8 8個(gè)濃度，取個(gè)濃度，取2424個(gè)平皿，分個(gè)平皿，分8 8組，組，每組每組3 3個(gè)取平均值。個(gè)取平均值。fkfk對(duì)對(duì)x x作圖。作圖。yk- - yoykyo檢品的效價(jià)檢定：檢品的效價(jià)檢定： 取取3 3個(gè)平皿，每個(gè)放個(gè)平皿，每個(gè)放6 6個(gè)小管。在間隔的個(gè)小管。在間隔的3 3個(gè)小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度個(gè)小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度(co),(co),另另3 3 個(gè)小管內(nèi)加入估計(jì)濃度相當(dāng)于個(gè)小管內(nèi)加入估計(jì)濃度相當(dāng)于coco的檢品溶液。測(cè)量出的檢品溶液。測(cè)量出f fk k, ,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出檢品的濃度，在換算出每毫克的計(jì)算出檢品

20、的濃度，在換算出每毫克的單位數(shù)。單位數(shù)。二劑量法：二劑量法： 將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品及檢品各稀釋成有將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品及檢品各稀釋成有一定比例的二種劑量（一定比例的二種劑量（2 2：1 1或或4 4：1 1），即），即高劑量和低劑量，在同一平板上進(jìn)行對(duì)比，高劑量和低劑量，在同一平板上進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈大小來(lái)計(jì)算檢品效價(jià)的根據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈大小來(lái)計(jì)算檢品效價(jià)的方法。方法。nsh:sh:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（ds2ds2）所致的抑菌圈）所致的抑菌圈直徑直徑nslsl：為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量：為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量(ds1)(ds1)所致的抑菌圈直所致的抑菌圈直徑徑nuhuh：為抗生

21、素檢品高劑量：為抗生素檢品高劑量(dt2)(dt2)所致的抑菌圈直徑所致的抑菌圈直徑nulul：為抗生素檢品低劑量：為抗生素檢品低劑量(dt1)(dt1)所致的抑菌圈直徑所致的抑菌圈直徑nnwivantidlog2slulshuhv2slshuluhwklhilogloglog要求：要求：1、高劑量抑菌圈直徑應(yīng)為、高劑量抑菌圈直徑應(yīng)為2024nm，個(gè)別，個(gè)別可為可為1824mm，高劑量與低劑量抑菌圈，高劑量與低劑量抑菌圈直徑之差應(yīng)大于或等于直徑之差應(yīng)大于或等于2mm。2、底層瓊脂、底層瓊脂20ml，上層，上層5ml，每一檢品所用，每一檢品所用平板不少于平板不少于4個(gè)。個(gè)。3、等距安置小鋼管、等

22、距安置小鋼管4個(gè)，相對(duì)角為同一物質(zhì)。個(gè)，相對(duì)角為同一物質(zhì)。4、 為為10010%（更精確要求（更精確要求1005%）5、標(biāo)準(zhǔn)品與檢品同質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)品與檢品同質(zhì)三劑量法：三劑量法： 應(yīng)用高、中、低三種劑量，在同一實(shí)應(yīng)用高、中、低三種劑量，在同一實(shí)驗(yàn)條件下比較標(biāo)準(zhǔn)品及檢品溶液的抑菌圈驗(yàn)條件下比較標(biāo)準(zhǔn)品及檢品溶液的抑菌圈大小，以求得檢品效價(jià)的方法。大小，以求得檢品效價(jià)的方法。s3:s3:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（ds3ds3）所致的抑菌圈直徑）所致的抑菌圈直徑s2: s2: 為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量（為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量（ds2ds2）所致的抑菌圈直徑）所致的抑菌圈直徑s1: s1: 為抗

23、生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量（為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量（ds1ds1）所致的抑菌圈直徑）所致的抑菌圈直徑u3u3：為抗生素檢品高劑量：為抗生素檢品高劑量(dt3)(dt3)所致的抑菌圈直徑所致的抑菌圈直徑u2u2：為抗生素檢品中劑量：為抗生素檢品中劑量(dt2)(dt2)所致的抑菌圈直徑所致的抑菌圈直徑u1: u1: 為抗生素檢品低劑量為抗生素檢品低劑量(dt1)(dt1)所致的抑菌圈直徑所致的抑菌圈直徑wivantidlog3123123sssuuuv41313ssuuwkilog要求：要求：1、標(biāo)準(zhǔn)品中劑量抑菌圈直徑、標(biāo)準(zhǔn)品中劑量抑菌圈直徑1518mm2、高、中、低劑距為、高、中、低劑距為1:0.83、每

24、一檢品不得少于、每一檢品不得少于6個(gè)平皿個(gè)平皿4、每板上等距安放小鋼管、每板上等距安放小鋼管6個(gè)個(gè)5、: 10010%（100%5%）三三 影響抗生素效價(jià)管碟法測(cè)定結(jié)果的影響抗生素效價(jià)管碟法測(cè)定結(jié)果的因素及其控制因素及其控制（一）影響抑菌圈形狀的因素與控制（一）影響抑菌圈形狀的因素與控制 1稀釋抗生素用的緩沖液的稀釋抗生素用的緩沖液的ph值、鹽濃度的影值、鹽濃度的影響響 . ph值低或含鹽濃度高，就會(huì)不顯抑菌圈或呈卵值低或含鹽濃度高，就會(huì)不顯抑菌圈或呈卵圓形抑菌圈。這是因?yàn)榭股厝芤旱柠}濃度高圓形抑菌圈。這是因?yàn)榭股厝芤旱柠}濃度高或或ph值過(guò)低，可能改變抗生素分子的解離狀態(tài)，值過(guò)低，可能改變

25、抗生素分子的解離狀態(tài)，影響了抗生素對(duì)試驗(yàn)菌抑制作用。影響了抗生素對(duì)試驗(yàn)菌抑制作用。 2制各瓊脂培養(yǎng)基菌層，加菌時(shí)培養(yǎng)基溫度的制各瓊脂培養(yǎng)基菌層，加菌時(shí)培養(yǎng)基溫度的影響影響 3測(cè)試用的器材洗凈度的影響測(cè)試用的器材洗凈度的影響 4 雙碟培養(yǎng)溫度的影響雙碟培養(yǎng)溫度的影響 5 其他操作的影響其他操作的影響（二）影響抑菌圈邊緣清晰度的因素與控制（二）影響抑菌圈邊緣清晰度的因素與控制 1 試驗(yàn)菌長(zhǎng)時(shí)間放置菌群中的一些菌株生理特試驗(yàn)菌長(zhǎng)時(shí)間放置菌群中的一些菌株生理特性有所變化，或是生長(zhǎng)速度改變，或?qū)股氐男杂兴兓蚴巧L(zhǎng)速度改變，或?qū)股氐拿舾卸扔兴兓?，往往出現(xiàn)雙圈，抑菌圈的邊緣敏感度有所變化，往

26、往出現(xiàn)雙圈，抑菌圈的邊緣不清。不清。 在檢定時(shí)菌層培養(yǎng)基中的菌量影響抑菌圈，菌層在檢定時(shí)菌層培養(yǎng)基中的菌量影響抑菌圈，菌層培養(yǎng)基中的菌量過(guò)低，抑菌圈邊緣模糊不清，菌培養(yǎng)基中的菌量過(guò)低，抑菌圈邊緣模糊不清，菌量過(guò)高、使抑菌圈太小并且影響試驗(yàn)菌靈敏度。量過(guò)高、使抑菌圈太小并且影響試驗(yàn)菌靈敏度。因此，在正式檢測(cè)之前，找出最適菌量。因此，在正式檢測(cè)之前，找出最適菌量。 2 培養(yǎng)基的原材料品種與質(zhì)量，生測(cè)用培養(yǎng)基用培養(yǎng)基的原材料品種與質(zhì)量，生測(cè)用培養(yǎng)基用的原材料的選擇很重要。的原材料的選擇很重要。 3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph值或增加適量的鹽濃度可使抑值或增加適量的鹽濃度可使抑菌圈清晰菌圈清晰. 4不

27、適當(dāng)延長(zhǎng)雙碟的培養(yǎng)時(shí)間，使抑菌圈邊緣不適當(dāng)延長(zhǎng)雙碟的培養(yǎng)時(shí)間，使抑菌圈邊緣不清。不清?？股匦r(jià)管碟法測(cè)定的操作技術(shù)抗生素效價(jià)管碟法測(cè)定的操作技術(shù)操作分為八步：操作分為八步：1 1試驗(yàn)菌的純化與懸液的制備試驗(yàn)菌的純化與懸液的制備2 2 緩沖液、滅菌水與培養(yǎng)基的制備緩沖液、滅菌水與培養(yǎng)基的制備3 3標(biāo)準(zhǔn)品、供試品的稱(chēng)量、溶解與稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、供試品的稱(chēng)量、溶解與稀釋4 4 雙碟的制備及放管雙碟的制備及放管5 5 滴加藥液滴加藥液6 6恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)7 7 測(cè)量抑菌圈直徑或面積測(cè)量抑菌圈直徑或面積8 8 計(jì)算計(jì)算操作流程：操作流程：四、比濁法與管碟法比較比濁法比濁法管碟法管碟法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 1、快速、快

28、速1、結(jié)果較穩(wěn)定、結(jié)果較穩(wěn)定2、客觀、精確、客觀、精確2、大批量、大批量3、無(wú)擴(kuò)散影響、無(wú)擴(kuò)散影響缺點(diǎn)缺點(diǎn) 1、對(duì)樣品潔凈度、對(duì)樣品潔凈度要求高要求高1、擴(kuò)散因素影響較、擴(kuò)散因素影響較大大2、實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)、實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)2、時(shí)間長(zhǎng)（、時(shí)間長(zhǎng)（2天天)第二節(jié) 抗生素類(lèi)藥物的鑒別一、一、-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的鑒別內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的鑒別結(jié)構(gòu)的共同點(diǎn)：結(jié)構(gòu)的共同點(diǎn)：1 1、和內(nèi)酰胺相鄰的碳原子上有一、和內(nèi)酰胺相鄰的碳原子上有一羧基，羧基，2 2、內(nèi)酰胺中氮原子相對(duì)的碳原子上有一、內(nèi)酰胺中氮原子相對(duì)的碳原子上有一功能團(tuán)氨基。功能團(tuán)氨基。 分類(lèi)：青霉烷類(lèi)，頭孢烯類(lèi)，碳青霉烯類(lèi)（硫霉分類(lèi)：青霉烷類(lèi)，頭孢烯類(lèi)，碳青霉

29、烯類(lèi)（硫霉素），單環(huán)素），單環(huán)-內(nèi)酰胺（克拉維酸）。內(nèi)酰胺（克拉維酸）。鑒別：鑒別： 1 1、酶法：、酶法： -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶2 2、紅外吸收光譜法：、紅外吸收光譜法：3000-2800(c-h),3350cm3000-2800(c-h),3350cm-1-1(n-(n-h),1800-1600(h),1800-1600(羰基羰基) )，1460-13751460-1375（甲基或次甲基）（甲基或次甲基）3 3、紫外吸收光譜法、紫外吸收光譜法4 4、茚三酮反應(yīng)：、茚三酮反應(yīng)：是是氨基的反應(yīng)，與茚三酮縮合，氨基的反應(yīng)，與茚三酮縮合， 生成藍(lán)紫色化合物。生成藍(lán)紫色化合物。 5 5、色譜法：、色譜

30、法：薄層色譜后，氯鉑酸與硫醚基反薄層色譜后，氯鉑酸與硫醚基反應(yīng)是靈敏度高的顯色試劑應(yīng)是靈敏度高的顯色試劑 二、氨基糖苷類(lèi)抗生素二、氨基糖苷類(lèi)抗生素環(huán)己醇配基以糖苷鍵與氨基糖相連。環(huán)己醇配基以糖苷鍵與氨基糖相連。鏈霉素，布魯霉素，卡那霉素，慶大霉素，新霉素。鏈霉素，布魯霉素，卡那霉素，慶大霉素，新霉素。 （一）呈色反應(yīng)（一）呈色反應(yīng)1、茚三酮反應(yīng)：、茚三酮反應(yīng)：2、坂口反應(yīng)：、坂口反應(yīng)：鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍特有。鏈霉胍，鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍特有。鏈霉胍，8-羥喹啉羥喹啉分別與次溴酸鈉反應(yīng)，其各自的產(chǎn)物在相互作用生成橙紅色化分別與次溴酸鈉反應(yīng)，其各自的產(chǎn)物在相互作用生成橙紅色化合物。合物。 3、糖

31、類(lèi)反應(yīng)：莫利西反應(yīng)、糖類(lèi)反應(yīng)：莫利西反應(yīng) 脫水脫水 -奈酚奈酚糖糖 糠醛糠醛 紅紫色產(chǎn)物紅紫色產(chǎn)物4、埃爾松、埃爾松-摩根：摩根：樣品在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水解后釋放出氨樣品在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水解后釋放出氨基乙糖，在堿性條件下與乙酰丙酮縮合，形成吡咯樣基乙糖，在堿性條件下與乙酰丙酮縮合，形成吡咯樣的衍生物，在堿性條件下與對(duì)二甲胺基苯甲醛的乙醇的衍生物，在堿性條件下與對(duì)二甲胺基苯甲醛的乙醇及鹽酸溶液成紅色，在及鹽酸溶液成紅色，在540nm處可定量測(cè)定。處可定量測(cè)定。5、麥芽酚反應(yīng)：、麥芽酚反應(yīng)： 水解、重排水解、重排 fe3+鏈霉糖鏈霉糖 麥芽酚麥芽酚 紫紅色絡(luò)合物紫紅色絡(luò)合物 oh- h+三、四環(huán)類(lèi)抗生素三、

32、四環(huán)類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu):氫化四駢苯氫化四駢苯,四環(huán)素，土霉素，金霉素，強(qiáng)力霉素。四環(huán)素，土霉素，金霉素，強(qiáng)力霉素。 （一）呈色反應(yīng)（一）呈色反應(yīng) 1、濃硫酸反應(yīng)、濃硫酸反應(yīng) 四環(huán)素四環(huán)素 深紫色；深紫色； 金霉素金霉素 藍(lán)色至綠色；藍(lán)色至綠色； 土霉素土霉素 朱紅色；朱紅色； 強(qiáng)力霉素強(qiáng)力霉素 黃色；黃色； 2、三氯化鐵反應(yīng)：酚羥基、三氯化鐵反應(yīng)：酚羥基 （二）熒光反應(yīng)（二）熒光反應(yīng):土霉素綠色熒光，四環(huán)素黃色土霉素綠色熒光，四環(huán)素黃色熒光熒光 （三）紫外光譜（三）紫外光譜 （四）色譜（四）色譜四、大環(huán)內(nèi)酯抗生素四、大環(huán)內(nèi)酯抗生素 結(jié)構(gòu)：一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為母核，通過(guò)糖苷鍵結(jié)構(gòu)：一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為母核

33、，通過(guò)糖苷鍵與與1-31-3個(gè)糖相連。個(gè)糖相連。 （紅霉素，螺旋霉素，柱晶紅霉素，螺旋霉素，柱晶白霉素白霉素 ） （一）呈色反應(yīng)（一）呈色反應(yīng) 1、硫酸反應(yīng)：、硫酸反應(yīng)：遇硫酸均呈紅棕色遇硫酸均呈紅棕色 2、莫利西反應(yīng)：糖類(lèi)的反應(yīng)、莫利西反應(yīng)：糖類(lèi)的反應(yīng) 3、seliwanaff 反應(yīng)：反應(yīng)： 脫水脫水 間苯二酚間苯二酚糖糖 糖醛衍生物糖醛衍生物 具顏色產(chǎn)物具顏色產(chǎn)物 紅霉素紅霉素 淡黃色；淡黃色； 螺旋霉素螺旋霉素 亮紫紅色；亮紫紅色；碳霉素碳霉素 深青紫色；深青紫色； 柱晶白霉素柱晶白霉素 淡青色；淡青色；（二）薄層色譜（二）薄層色譜(三三) 光譜學(xué)鑒別光譜學(xué)鑒別紫外光譜紫外光譜紅外光譜紅

34、外光譜五、利福霉素類(lèi)抗生素的鑒別五、利福霉素類(lèi)抗生素的鑒別結(jié)構(gòu)：一個(gè)脂肪鏈經(jīng)過(guò)酰胺鍵與一個(gè)平面的芳香基團(tuán)結(jié)構(gòu)：一個(gè)脂肪鏈經(jīng)過(guò)酰胺鍵與一個(gè)平面的芳香基團(tuán)連接成一個(gè)環(huán)橋式化合物，所以又稱(chēng)環(huán)橋類(lèi)抗生素。連接成一個(gè)環(huán)橋式化合物，所以又稱(chēng)環(huán)橋類(lèi)抗生素。代表藥物：利福平（代表藥物：利福平（rifampicinrifampicin）鑒別：鑒別：呈色反應(yīng)：呈色反應(yīng)：1 1濃鹽酸反應(yīng)：濃鹽酸反應(yīng)：2 2三氯化鐵：，向三氯化鐵：，向1 1毫升利福霉素的溶液中，滴加三氯毫升利福霉素的溶液中，滴加三氯化鐵乙醇溶液，有綠色，藍(lán)綠色。表明有酚羥基化鐵乙醇溶液，有綠色，藍(lán)綠色。表明有酚羥基3 3硝酸鹽反應(yīng)：利福平，溶液中加

35、入硝酸鈉溶液，顏色硝酸鹽反應(yīng)：利福平，溶液中加入硝酸鈉溶液，顏色由橙色變?yōu)榘导t色。由橙色變?yōu)榘导t色。六、多肽類(lèi)抗生素：六、多肽類(lèi)抗生素： 抗感染的桿菌肽（抗感染的桿菌肽（bacitracinbacitracin）、多粘）、多粘菌素、萬(wàn)古霉素。用于癌癥治療的放線菌蘇菌素、萬(wàn)古霉素。用于癌癥治療的放線菌蘇d d、搏來(lái)霉素。、搏來(lái)霉素。鑒別：鑒別：茚三酮反應(yīng)：茚三酮反應(yīng)：磷鎢酸反應(yīng)：磷鎢酸反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)：第三節(jié)第三節(jié) 抗生素類(lèi)藥物的雜質(zhì)檢查抗生素類(lèi)藥物的雜質(zhì)檢查一、高分子雜質(zhì)、降解產(chǎn)物及異構(gòu)體一、高分子雜質(zhì)、降解產(chǎn)物及異構(gòu)體 1、青霉素、青霉素 過(guò)敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白過(guò)敏原

36、：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白 凝膠過(guò)濾法分離，用凝膠過(guò)濾法分離，用penamaldate法測(cè)定法測(cè)定 hgcl2 青霉噻唑衍生物青霉噻唑衍生物 penamaldate 半合成半合成-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中微量雜質(zhì)內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中微量雜質(zhì)n,nn,n二二甲基苯胺的測(cè)定：甲基苯胺的測(cè)定：2、鏈霉素、鏈霉素毒性雜質(zhì)毒性雜質(zhì): 鏈霉胍鏈霉胍,鏈胍雙氫鏈糖鏈胍雙氫鏈糖;雙氫鏈霉素雙氫鏈霉素;鏈霉素醛鏈霉素醛基結(jié)合物基結(jié)合物; 神經(jīng)毒性：二鏈霉胺神經(jīng)毒性：二鏈霉胺二鏈霉胺含量測(cè)定原理二鏈霉胺含量測(cè)定原理:二鏈霉胺等不被二鏈霉胺等不被kbh4還原，能與鹽酸氨基脲還原，能與鹽酸氨基脲反應(yīng)，生成的縮氨脲在反應(yīng)，生成的

37、縮氨脲在233nm有吸收峰有吸收峰3、土霉素、土霉素 脫水土霉素、差向土霉素、脫水土霉素、差向土霉素、-阿撲土阿撲土霉素、霉素、-阿撲土霉素等降解產(chǎn)物阿撲土霉素等降解產(chǎn)物 薄層分離，熒光測(cè)定薄層分離，熒光測(cè)定4、四環(huán)素、四環(huán)素 脫水四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向脫水脫水四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素四環(huán)素 hplc測(cè)定測(cè)定二、無(wú)機(jī)雜質(zhì)的檢查二、無(wú)機(jī)雜質(zhì)的檢查三、溶媒殘留量三、溶媒殘留量 1、比色法：、比色法： 甲醇氧化成甲醛，用品紅試劑測(cè)定甲醇氧化成甲醛，用品紅試劑測(cè)定 丙酮與水楊醛縮合比色丙酮與水楊醛縮合比色 醋酸丁酯與鹽酸羥胺反應(yīng)后比色測(cè)定醋酸丁酯與鹽酸羥胺反應(yīng)后比色測(cè)定 2、氣相色譜氣相色

38、譜 3、hplc 4、紅外光譜、紅外光譜青霉素鈉青霉素鈉 拼音名：拼音名：qingmeisuna 英文名：英文名：benzylpenicillin sodium c16h17n2nao4s 356.38 本品為本品為(2s,5r,6r)-3,3- 二甲基二甲基-6-(2-苯乙酰氨基苯乙酰氨基)-7- 氧代氧代-4- 硫雜硫雜-1- 氮雜雙環(huán)氮雜雙環(huán)3.2.0 庚烷庚烷-2- 甲酸鈉甲酸鈉鹽。按無(wú)水物計(jì)算，含青霉素按鹽。按無(wú)水物計(jì)算，含青霉素按c16h17n2nao4s 計(jì)算，不得少于計(jì)算，不得少于96.0 【性狀】【性狀】 本品為白色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭或微有特異性本品為白色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭或微有特異性臭；有引濕性；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失