酶工程實(shí)驗(yàn)生物工程09VIP

1、本實(shí)驗(yàn)共有六個(gè)分實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)共有六個(gè)分實(shí)驗(yàn) : :實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 酵母蔗糖酶的純化與純度測定酵母蔗糖酶的純化與純度測定 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純度聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純度 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 酵母蔗糖酶的結(jié)晶（選做）酵母蔗糖酶的結(jié)晶（選做） 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 酵母蔗糖酶的固定化酵母蔗糖酶的固定化 實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 酵母蔗糖酶活性功能基團(tuán)的化學(xué)修飾酵母蔗糖酶活性功能基團(tuán)的化學(xué)修飾酵母中含有豐富的蔗糖酶(ec.3.2.1.26) 細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)，含有少胞質(zhì)，含有少量的糖。量的糖。外蔗糖酶外蔗糖酶內(nèi)蔗糖酶內(nèi)蔗糖酶細(xì)胞

2、膜的外側(cè)，占細(xì)胞膜的外側(cè)，占蔗糖酶活力的大部蔗糖酶活力的大部分，是含有分，是含有50% 50% 糖糖成分的糖蛋白。成分的糖蛋白。由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。 本實(shí)驗(yàn)以酵母為原料，通過破碎細(xì)胞、加熱除雜蛋白、乙醇沉淀、離子交換柱層析等步驟，分離純化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝膠電泳對(duì)其純度進(jìn)行初步檢驗(yàn)。 有機(jī)溶劑分級(jí)的原理：有機(jī)溶劑分級(jí)是利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有有機(jī)溶劑分級(jí)的原理：有機(jī)溶劑分級(jí)是利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。機(jī)溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。其原

3、理是：其原理是：1 1、有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引、有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)溶解度下降；力，使蛋白質(zhì)溶解度下降；2 2、有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下、有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。降。 結(jié)合力的大小取決于彼此之間相反電荷基團(tuán)的靜電引力 靜電引力大小與溶液的ph值有關(guān)，因ph值決定蛋白質(zhì)的解離程度。nh3rcooh+nh3rcoo+-rnh2coo-low phpositive chargehigh phnegative chargehydrogen gai

4、nedhydrogen lost陽離子交換劑 樣品溶液phpi時(shí)，酶帶正電荷；陰離子交換劑 樣品溶液phpi時(shí)，酶帶負(fù)電荷一般樣品溶液的ph與酶pi相差一個(gè)ph以上 樣品溶液的ph與酶pi相差越大的，帶電荷越多 通過逐漸增加洗脫液離子強(qiáng)度的梯度洗脫方式，可使結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)按照結(jié)合力由小到大的順序依次被洗出層析柱。 sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+anionexchangerbead- 本實(shí)驗(yàn)中使用的本實(shí)驗(yàn)中使用的deae-deae-5252是弱堿性的是弱堿性的陰離子陰離子纖維纖維素，其基本骨架是纖維素

5、素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為、活性基團(tuán)為二乙基氨乙二乙基氨乙基（基（deaedeae）。該纖維素的。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定?？刂疲簶悠啡芤簆hpi時(shí)，酶帶負(fù)電荷離子交換柱層析的原理：離子交換柱層析的原理：根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)在分離根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)在分離過程中，以離子交換劑作用為主導(dǎo)。在眾多的交換劑中，離子交換纖過程中，以離子交換劑作用為主導(dǎo)。在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)是：維素的優(yōu)點(diǎn)是：1 1、開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對(duì)蛋白質(zhì)吸附容量大；、開

6、放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對(duì)蛋白質(zhì)吸附容量大；2 2、纖維素上離子基團(tuán)數(shù)量不多且排列疏散，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固、纖維素上離子基團(tuán)數(shù)量不多且排列疏散，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離目的，不致引起蛋白質(zhì)變，所以用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離目的，不致引起蛋白質(zhì)變3 3、用其裝好的層析柱在較廣的、用其裝好的層析柱在較廣的phph和鹽濃度范圍內(nèi)都不會(huì)發(fā)生體積的改變和鹽濃度范圍內(nèi)都不會(huì)發(fā)生體積的改變，所以有利于蛋白質(zhì)層析。，所以有利于蛋白質(zhì)層析。本實(shí)驗(yàn)中使用的本實(shí)驗(yàn)中使用的deae-52deae-52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為是弱堿性的陰

7、離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為二乙基氨乙基（二乙基氨乙基（deaedeae）。該纖維素的吸附量。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 為了確定哪個(gè)峰是含目標(biāo)酶，要進(jìn)行酶活力的測定； 用蔗糖做底物反應(yīng)一段時(shí)間后，檢測生成的葡萄糖的量；用尿糖試紙初步檢測；用dns法精確檢測。 sucrase（蔗糖酶）glucosefructosesucrosesemi-quantitative assay of yeast sucrase activity with u-glu test-tapesucroseglucoseoxidase（葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶

8、） gluconicacidh2o2（葡萄糖酸（葡萄糖酸 ）h2o+o2-colouredsubstancesucrase（蔗糖酶）glucosefructosehydrogenperoxidase（過氧化過氧化氫酶）氫酶）colourlesssubstance（無色物質(zhì)）（無色物質(zhì)）u-glu test-tape尿糖試紙 dns法精確檢測 黃色的3,5-二硝基水楊酸（dns）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又與待測液的酶活力大小成正比。酶活定義： 在37 ，ph4.5，每分鐘催化

9、蔗糖生成1m葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。 dns法測葡萄糖濃度管號(hào)管號(hào)操作操作空白空白標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度樣品樣品012345ab葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液液mg/mlmg/ml0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1醋酸醋酸bufferbuffer1 11 11 11 11 11 11 11 1待測酶液待測酶液0 00 00 00 00 00 0200微微升升200微微升升3737準(zhǔn)確反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)10 min10 min，1 ml 1 mol/l naoh1 ml 1 mol/l n

10、aoh終止酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑水楊酸試劑（dnsdns）1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml沸水浴精確反應(yīng)沸水浴精確反應(yīng)5 min,5 min,冷卻后定容至冷卻后定容至20 ml20 ml 附圖：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定獲得的目標(biāo)酶純不純，要進(jìn)行sds-page電泳檢測； 二、實(shí)驗(yàn)步驟1.1.破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于預(yù)先冷卻的研缽中，加30 ml去離子水，研磨30 min，在冰箱中冰凍約10 min（研磨液面上剛出現(xiàn)冰結(jié)為宜），重復(fù)2次。將研磨液轉(zhuǎn)移至大離心管中，12000 r/min離心15

11、 min，棄去沉淀。留0.5 ml上清液為第一組分。2.2.加熱除雜蛋白加熱除雜蛋白 將上清液轉(zhuǎn)入三角瓶，用1 mol/l醋酸溶液逐滴加入，調(diào)其ph值至5.0，然后迅速放入50的水浴中，保溫30 min。在溫育過程中，注意經(jīng)常緩慢攪拌液體。之后在冰浴中迅速冷卻之，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄去沉淀。留0.5 ml上清液為第二組分。 3.3.乙醇沉淀乙醇沉淀 量出上清液的體積，加入等體積的95%冷乙醇溶液(預(yù)先放在-20低溫下的時(shí)間不少于30 min)，于冰浴中溫和攪拌20 min。然后以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心25 min，小心棄去上清液，沉淀瀝干。將沉淀溶解在6

12、 ml 0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(ph值7.3)中，攪拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心25 min，取出0.5 ml上清液作為第三組分，剩余部分(乙醇抽提液)進(jìn)行第4步操作。 4 4. .上柱上柱 裝deae-sepharose fast flow離子交換柱層析，用0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(ph值7.3)平衡。將乙醇抽提液上柱，上樣后用0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(ph值7.3)平衡，然后用0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(內(nèi)含0.5 mol/l nacl溶液，ph值7.3)進(jìn)行nacl梯度

13、(nacl溶液濃度為0-0.5 mol/l)洗脫。 層析柱連上梯度混合器，混合器分別裝30 ml 0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(ph值7.3)和30 ml含有0.5 mol/l nacl的0.05 mol/l tris-hcl緩沖液(ph值7.3)，每1 min收集1管。洗脫至混合器中液體流完為止，測定各接收管在280 nm下的光吸收值，并用尿糖試紙半定量測定各管的酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作為第四組分用于純度測定。5.用尿糖試紙進(jìn)行半定量測定： 在白瓷板每孔中分別滴3滴待測酶液，再加3滴含10蔗糖的ph 4.5的醋酸緩沖液，攪勻，37放置10 min，浸入尿糖試紙，1

14、s后取出，60 s后比較顏色的深淺，與比色卡對(duì)照。6. dns法精確檢測 管號(hào)管號(hào)操作操作空空白白標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度樣品樣品012345ab葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液液mg/mlmg/ml0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1醋酸醋酸bufferbuffer1 11 11 11 11 11 11 11 1待測酶液待測酶液0 00 00 00 00 00 0100微微升升100微微升升3737準(zhǔn)確反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)10 min10 min，1 ml 1 mol/l naoh1 ml 1 mo

15、l/l naoh終止酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑水楊酸試劑（dnsdns）1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1ml l1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml沸水浴精確反應(yīng)沸水浴精確反應(yīng)5 min,5 min,冷卻后定容至冷卻后定容至20 ml20 ml 試劑配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制（1mg/ml1mg/ml）：預(yù)先將分析純葡萄糖置：預(yù)先將分析純葡萄糖置8080烘箱內(nèi)約烘箱內(nèi)約1212小時(shí)。準(zhǔn)確稱取小時(shí)。準(zhǔn)確稱取500mg500mg葡萄糖于燒杯中，葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至用蒸餾水溶解后，移至500ml500ml容量瓶中，定容，搖勻（冰容量瓶中，定容，

16、搖勻（冰箱中箱中44保存期約一星期）。保存期約一星期）。醋酸醋酸buffer(0.2mol/l)buffer(0.2mol/l)稱取稱取3.28g3.28g無水乙酸鈉，溶解于無水乙酸鈉，溶解于150ml150ml蒸餾水，用冰乙酸調(diào)節(jié)其蒸餾水，用冰乙酸調(diào)節(jié)其phph至至4.54.5，然后定溶至，然后定溶至200ml200ml。10%10%蔗糖溶液：蔗糖溶液：10g10g蔗糖溶解于蔗糖溶解于醋酸醋酸buffer(0.2mol/l)buffer(0.2mol/l)中，定容至中，定容至100ml100ml1mol/l naoh1mol/l naoh溶液：溶液：4gnaoh4gnaoh溶解于溶解于100

17、ml100ml蒸餾水中蒸餾水中四、結(jié)果分析四、結(jié)果分析 以梯度洗脫出的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度a280、酶活、nacl濃度為縱坐標(biāo)，繪出層析曲線和酶活曲線圖。五 思考題： 離子交換纖維素層析的優(yōu)點(diǎn)有哪些？ 有機(jī)溶劑抽提蛋白質(zhì)的原理是什么？數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 review total activityspecific activityhow to calculate it, what it means, how it changes during a purificationfold purificationwhat it is, how to calculate ityieldwhat it is

18、, how to calculate it, how it changes during a purification兩重要概念兩重要概念1 1：回收率是純化后的總活力除以純化前的總：回收率是純化后的總活力除以純化前的總活力活力2 2： 純化倍數(shù)是純化后的比活力除以純化前純化倍數(shù)是純化后的比活力除以純化前的比活力（第一次的比活力）的比活力（第一次的比活力）注：比活力：比活力活力單位數(shù)注：比活力：比活力活力單位數(shù)mgmg蛋白蛋白 （1 1）丙烯酰胺和）丙烯酰胺和n, n-n, n-亞甲雙丙烯酰胺。亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配制含

19、有制含有29%29%（w/vw/v）丙烯酰胺和）丙烯酰胺和1%1%（w/vw/v）n, n, n-n-亞甲雙丙烯酰胺的貯存液亞甲雙丙烯酰胺的貯存液 。（2）1.5m tris，ph8.8（分離膠緩沖液）：1.5m tris-hcl，0.4% sds（3）0.5m tris，ph6.8（濃縮膠緩沖液）：0.5m tris-hcl，0.4% sds（4）10%過硫酸銨以上先配！等待凝膠聚合時(shí)再配！（8）tris-甘氨酸電泳緩沖液(ph 8.3)：0.025m tris，0.192m 甘氨酸，0.1% sds（9）樣品處理液：50mm tris-hcl(ph 6.8)，100mm dtt(or 5%

20、 巰基乙醇)，2% sds，0.1% 溴酚藍(lán)，10%甘油（10）染色液：0.1% 考馬斯亮藍(lán) r250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脫色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸 （1 1）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板（2 2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入一定體積的分離膠溶液。一旦加入temedtemed，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。進(jìn)入下步操作。（3 3）迅速在兩玻

21、璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液, ,留出灌注濃縮膠所需空間留出灌注濃縮膠所需空間( (梳子的齒長再加梳子的齒長再加0.5cm)0.5cm)。再在膠液面上小心注入一層水（約再在膠液面上小心注入一層水（約23mm23mm高），以阻高），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（4 4）分離膠聚合完全后（約）分離膠聚合完全后（約3030分鐘），傾出覆蓋水分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。層，再用濾紙吸凈殘留水。 （5）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入temed，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混

22、合物并進(jìn)入下步操作。（6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。（7）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1:1體積比加入樣品處理液，在100加熱3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。 （8）濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入tris-甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。 將100ul蛋白樣品與100ul樣品處理液混合均勻，然后將此混合液在100攝氏度中水浴10min，冷卻至室溫后，12000rpm離心10分鐘，即做成電泳樣品

23、。（1）按予定順序加樣，加樣量通常為1025l（1.5mm厚的膠）。（2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8v/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15v/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。 （3 3）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。 經(jīng)sds聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)r250染色。染色12小時(shí)或過夜。 需需3 31010小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清小時(shí)，其

24、間更換多次脫色液至背景清楚楚 脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。為永久性記錄，可對(duì)袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。為永久性記錄，可對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。此方法凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。此方法檢測靈敏度為檢測靈敏度為0.20.21.0g1.0g。 觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷酶的觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷酶的純度，拍出電泳酶純度的檢驗(yàn)結(jié)果。純度，拍出電泳酶純度的檢驗(yàn)結(jié)果。 （蒸發(fā)和沉淀法相結(jié)合的懸滴蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法）一、原理一、原理 將含有一定鹽濃度的緩沖液與含有低于這種鹽濃度的蛋白質(zhì)混合溶液在一個(gè)密封體系內(nèi)一起蒸發(fā)擴(kuò)散，最

25、后達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)溶液內(nèi)鹽濃度提高，而ph值接近待結(jié)晶蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的緩沖液又使中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的鹽析作用更為顯著，因此導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，溶液逐漸達(dá)到過飽和而析出結(jié)晶。二、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1.1.用用“吹氣法吹氣法”除去酒精泡洗后的除去酒精泡洗后的2424孔組織孔組織培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵，以防培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵，以防形成不必要的成核中心而影響晶體的觀察形成不必要的成核中心而影響晶體的觀察。 2.在24孔組織培養(yǎng)板的某孔中加入1 ml含0.2 mol/l nacl的磷酸緩沖液（ph 6.5）作為池液,孔邊緣均勻涂抹上高真空油脂，勿使其進(jìn)入孔內(nèi)。 3.吸取1 l待結(jié)晶酶蛋

26、白溶液置蓋玻片中央, 加等體積池液至此液滴中，用槍頭輕輕地的吹吸液滴以保證混合液的均勻性并避免氣泡出現(xiàn)。4.小心、迅速地翻轉(zhuǎn)蓋玻片并蓋在培養(yǎng)板的孔上, 旋轉(zhuǎn)45度以保證密封良好。5.室溫下靜置狀態(tài)培養(yǎng)一周以上。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一周后于體視鏡下觀察酵母蔗糖酶的一周后于體視鏡下觀察酵母蔗糖酶的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究一、實(shí)驗(yàn)原理 酶學(xué)性質(zhì)的研究酶學(xué)性質(zhì)的研究包括：最適溫度、最適ph、米氏常數(shù)、激活劑、抑制劑等。 一般通過單因素實(shí)驗(yàn)確定。二、實(shí)驗(yàn)步驟配如下溶液：0.2mol/l磷酸氫二鈉 0.2mol/l乙酸鈉 0.2mol/l檸檬酸 0.

27、2mol/l乙酸 0.2mol/l磷酸二氫鈉 1、最適ph的測定 （1）按下表配制緩沖溶液 將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10ml，其溶液ph值以酸度計(jì)測量值為準(zhǔn)。溶液溶液ph 緩沖試劑緩沖試劑體積體積ml 緩沖試劑緩沖試劑體積體積ml 2.50.2mol/l磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 2.000.2mol/l檸檬酸檸檬酸 8.00 3.00.2mol/l磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 3.650.2mol/l檸檬酸檸檬酸 6.35 4.00.2mol/l乙酸鈉乙酸鈉 1.800.2mol/l乙酸乙酸 8.20 5.00.2mol/l乙酸鈉乙酸鈉 7.000.2mol/l乙酸乙酸 3.00 6.00.2mol

28、/l乙酸鈉乙酸鈉 9.500.2mol/l乙酸乙酸 0.50 7.00.2mol/l磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 6.100.2mol/l磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉 3.90（2） 準(zhǔn)備二組各7支試管，第一組7支試管每支都加入0.2ml上表中相應(yīng)的緩沖液，然后加入一定量的蔗糖酶。另一組7支試管也是每支都加入0.2ml上表中相應(yīng)的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時(shí)的空白對(duì)照管。所有的試管都用水補(bǔ)足到0.8ml。 4.米氏常數(shù)（km）的測定 比色管號(hào)1234567蔗糖溶液00.10.20.40.81.62ddh2o21.91.81.61.20.40醋酸buffer1111111游離酶1111

29、11137準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)水楊酸試劑1111111沸水浴精確反應(yīng)5 min,冷卻后定容至20 mla5406. dns法精確檢測 管號(hào)管號(hào)操作操作空空白白標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度樣品樣品012345ab葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液mg/mlmg/ml0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 各種各種phph緩沖液緩沖液1 11 11 11 11 11 11 11 1待測酶液待測酶液0 00 00 00 00 00 0100微微升升100微微

30、升升3737準(zhǔn)確反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)10 min10 min，1 ml 1 mol/l naoh1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑（水楊酸試劑（dnsdns）1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1ml l1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml沸水浴精確反應(yīng)沸水浴精確反應(yīng)5 min,5 min,冷卻后定容至冷卻后定容至20 ml20 ml a540 （3） 所有的試管按一定時(shí)間間隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/l)開始反應(yīng)，反應(yīng)10min后分別加入1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應(yīng)5 min,冷卻后定容

31、至20 ml，然后測定a540的吸光值。 2、最適溫度的測定 測定室溫、30、40、50、60、70、80、 90不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應(yīng)速度。 每個(gè)溫度準(zhǔn)備1支試管，以乙酸緩沖液作為緩沖液。6. dns法精確檢測 管號(hào)管號(hào)操作操作空空白白標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度樣品樣品012345ab葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液mg/mlmg/ml0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 醋酸緩沖液醋酸緩沖液ph4.5ph4.51 11 11 11 11 11 11 11 1待測酶液待測酶液0

32、00 00 00 00 00 0100微微升升100微微升升各個(gè)溫度環(huán)境下準(zhǔn)確反應(yīng)各個(gè)溫度環(huán)境下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min10 min，1 ml 1 mol/l naoh1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑（水楊酸試劑（dnsdns）1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1ml l1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml沸水浴精確反應(yīng)沸水浴精確反應(yīng)5 min,5 min,冷卻后定容至冷卻后定容至20 ml20 ml （1） 確定酶的稀釋倍數(shù)，試管中加入0.2ml 0.2mol/l ph4.5的乙酸緩沖液，0.2ml稀釋的酶，加水至0.8ml 加入1ml 1

33、0%的蔗糖開始計(jì)時(shí)，在室溫下反應(yīng)10min，后分別加入1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應(yīng)5 min,冷卻后定容至25 ml，然后測定a540的吸光值。 須得到0.20.3a的吸光度，準(zhǔn)備一個(gè)水的空白對(duì)照管用于測定所有的樣品管。 （2）測定上列各個(gè)溫度下的反應(yīng)速度，每次用1支試管，均加入0.2ml乙酸緩沖液均用水調(diào)至0.8ml，放入水浴溫度下使反應(yīng)物平衡30秒，加入10%蔗糖0.2ml，準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，后分別加入1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應(yīng)5 min,冷卻后定容至25 ml，然后測定a540的

34、吸光值。記錄每個(gè)水浴的準(zhǔn)確溫度。 （3） 酶催化的各管a540 值均進(jìn)行酸催化的校正。畫出酶催化的反應(yīng)速度對(duì)溫度的關(guān)系曲線。3.變性劑乙醇對(duì)游離酶活力的影響 比色管號(hào)比色管號(hào)1234567蔗糖溶液蔗糖溶液ml 1 111111醋酸醋酸buffer ml1111111無水乙醇無水乙醇ml 00.10.20.40.81.62ddh2o ml21.91.81.61.20.40乙醇終濃度乙醇終濃度02.5%5%10%20%40%50%酶酶ml011111137準(zhǔn)確反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)終止酶促反應(yīng)水楊酸試劑水楊酸試劑ml11111114.米氏常數(shù)（km

35、）的測定 比色管號(hào)1234567蔗糖溶液00.10.20.40.81.62ddh2o21.91.81.61.20.40醋酸buffer1111111游離酶111111137準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，1 ml 1 mol/l naoh終止酶促反應(yīng)水楊酸試劑1111111沸水浴精確反應(yīng)5 min,冷卻后定容至20 mla540三、結(jié)果分析1. 畫出蔗糖酶活性與ph的關(guān)系曲線。 2.畫出酶催化的反應(yīng)速度對(duì)溫度的關(guān)系曲線。3.畫出乙醇對(duì)酶催化的反應(yīng)速度影響的曲線。4.采用雙倒數(shù)作圖法得出蔗糖酶的km值。 實(shí)驗(yàn)四 蔗糖酶的固定化一、實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)用殼聚糖固定化酵母蔗糖酶屬共價(jià)偶聯(lián)法。 為了評(píng)價(jià)固定化方法的

36、好壞，需進(jìn)行酶回收率和酶相對(duì)活力的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)步驟1.1.殼聚糖載體的制備及戊二醛的偶聯(lián)殼聚糖載體的制備及戊二醛的偶聯(lián)（1）稱取3 g殼聚糖溶于98 ml蒸餾水中，攪拌均勻，再滴加2 ml冰醋酸，攪拌至均勻的粘稠狀；（2）稱取8 g naoh置大燒杯中，加入180 ml蒸餾水及20 ml甲醇。 （3）將拔出推塞的注射器架在鐵架臺(tái)上，倒入粘稠狀的殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液從20 cm高的注射器出口滴入大燒杯中，以制備殼聚糖微球載體。 （4）殼聚糖溶液滴加完畢后，靜止片刻，待微球完全沉入燒杯底部時(shí)，反復(fù)水洗多次至ph值中性，瀝干水分。加入1%戊二醛溶液100 ml，靜置2 h，使戊二醛偶聯(lián)于殼聚糖載體上。2.2.固定化酶的制備固定化酶的制備（1）將靜置2