制片染色及顯微觀察

1、 1清洗、消毒和滅菌操作清洗、消毒和滅菌操作 2培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 3采樣和取、制樣采樣和取、制樣 4接種、分離純化接種、分離純化 5制片、染色及顯微觀察制片、染色及顯微觀察 6實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí) 顯微鏡是微生物檢驗(yàn)中最常用的精密光學(xué)儀器。 顯微鏡的種類很多，在實(shí)驗(yàn)室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。 食品微生物檢驗(yàn)中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡。 顯微鏡的使用方法 用光學(xué)顯微用光學(xué)顯微鏡觀察微生物鏡觀察微生物形態(tài)時(shí)，一般形態(tài)時(shí)，一般遵循先遵循先低倍鏡低倍鏡觀察，觀察，后后高倍高倍鏡觀察，再油鏡觀察，再油鏡觀察鏡觀察 。低倍鏡操

2、作方法1.兩眼從側(cè)面注視 低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，使用粗調(diào)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當(dāng)物鏡鏡頭與載物臺(tái)的玻片相距23mm時(shí)停止；2.左眼注視 （注意右眼應(yīng)該同時(shí)睜著），并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐上升，直到看清物象為止；3. 再用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。 注意：注意：粗調(diào)調(diào)焦螺旋只用于上調(diào)載物臺(tái)，如觀察顯微鏡時(shí)，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，有壓碎載玻片、損壞物鏡的危險(xiǎn)。因此，用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)視野使其更清晰高倍鏡操作方法1.將低倍鏡觀察到的目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將低倍鏡鏡頭轉(zhuǎn)換成高倍鏡鏡頭。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，因此一般選用較大的光圈并使用反光鏡的凹面；3.用

3、微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。觀看的物體數(shù)目變少，但是體積變大。 注意：注意：高倍鏡觀察時(shí)，光線需增強(qiáng)。油鏡操作方法1.將高倍鏡觀察到的目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油；3.將油鏡鏡頭移動(dòng)至視野，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴(kuò)大為止）；4.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。 注意：注意：油鏡的操作需要較強(qiáng)的關(guān)線，故需將光線調(diào)至最強(qiáng)。 用10倍和/或40倍物鏡為隨后的高倍油鏡（90倍或100倍）選擇合適的視野（油鏡鏡筒上通?？逃衕.i.oil或oel等標(biāo)志）油鏡用后的處理：油鏡用后的處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留的

4、油跡；第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。普通顯微鏡的保養(yǎng) (1)觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。(2)用過油鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭23次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。 (4)將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置，罩上防塵套。 鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙 ，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。 5.2 制片和染色 染色原理染色原理 由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差, 必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景菌體與

5、背景形成明顯的色差形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。 微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。 細(xì)菌帶負(fù)電荷多，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。 微生物中細(xì)菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。 細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌的形態(tài)桿菌桿菌螺形菌螺形菌球菌球菌細(xì)菌的測(cè)量單位：細(xì)菌的測(cè)量單位：微米(m)

6、細(xì)菌的大小與形態(tài)(一一)簡單染色法簡單染色法 簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。(二二)復(fù)染色法復(fù)染色法 用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。 革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：u染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用g+表示；u染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用g表示。 細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蠟筆等。

7、2.草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃紅染液、石炭酸復(fù)紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌(一一)細(xì)菌的簡單染色步驟細(xì)菌的簡單染色步驟 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢1涂片涂片 取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。 3固定 手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰

8、外層盡快的來回通過23次，共約23秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5水洗 斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。 7鏡檢(二二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片涂片干燥干燥固定固定初染初染水洗水洗媒染媒染水洗水洗脫色脫色水洗水洗復(fù)染復(fù)染水洗水洗干燥干燥觀察觀察1取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染

9、色的相同。2用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3加碘液媒染1min后水洗。4斜置載玻片，滴加95乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色 為止，大約需時(shí)2030s，隨即水洗。5用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑 步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上 步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上 步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層 步驟4：風(fēng)干 步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘 步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片 步驟8：革蘭氏碘液

10、染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗 步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗 步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗 大腸桿菌（escherichia coli）革蘭氏染色圖 革蘭氏染色陰性桿菌（紅色） 金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureusstaphylococcus aureus）革蘭氏染色）革蘭氏染色 革蘭氏染色陽性球菌（紫色） 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須 嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2 選用培養(yǎng)18- -24小時(shí)菌齡小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。鞭毛化學(xué)組成：化學(xué)組成：鞭毛蛋白功能：功能：運(yùn)動(dòng)器官與致病有關(guān)鑒定分類細(xì)菌莢膜化學(xué)組成：化學(xué)組成