實驗十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA

1、實驗九實驗九 堿變性法小量制備質(zhì)粒堿變性法小量制備質(zhì)粒dna 一實驗?zāi)康募氨尘耙粚嶒災(zāi)康募氨尘皐質(zhì)粒是染色體外的dna分子，大小可為1kb到200kb。w大多數(shù)來自細菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子。w其復(fù)制和遺傳獨立于細菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒特點w質(zhì)粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。w質(zhì)粒通過細菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體， 是細菌有性繁殖的性因子.w年由lederburg正式命名為質(zhì)粒。質(zhì)粒類型w質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型： 松弛型質(zhì)粒 和 嚴緊型質(zhì)粒w1.松弛型質(zhì)粒

2、松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達2000-3000拷貝。2.嚴緊型質(zhì)粒w嚴緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。質(zhì)粒的應(yīng)用w大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。w嚴緊型質(zhì)粒用來表達一些可使宿主細胞受毒害致死的基因。w質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。本實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膚本實驗要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。分

3、離質(zhì)粒dna方法w從大腸桿菌中分離質(zhì)粒dna方法眾多，目前常用的w堿變性法；w煮沸法；wsds法；w 羥基磷灰石層析法等w各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高,提取的質(zhì)粒dna可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。堿變性法基本原理w在ph 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體dna變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒dna仍為自然狀態(tài)。w將ph調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體dna之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分dna和蛋白質(zhì)在去污劑sds的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒dna仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體dna、

4、rna及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒dna尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒dna。實驗試劑實驗試劑w培養(yǎng)基：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g 定容 1000ml ph 7.5nacl 10gw： 0.1m nacl10mm tris hcl(ph8.0)1mm edtaw 50mg/mlw溶菌酶 10mg/ml (用10mm trishcl ph8.0新鮮配制）試劑w溶液： 50mm 葡萄糖25mm trishcl（ph8.0）10mm edtaw溶液：（新鮮配制）0.2n naoh1% sdsw溶液： 5m kac 10ml冰醋酸 11.5ml水 28.5mlw酚，氯仿，乙醇 rnase 瓊脂糖w

5、： 10mm tris-hcl(ph8.0) 1mm edtapuc18鏈長鏈長2,686 bp puc18是適合于雙脫氧法dna測序的載體，在lacz領(lǐng)域中含有多克隆位點，因此在含有iptg， x-gal的平板培養(yǎng)基上，很容易判斷有無外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter表達外源基因。進行dna測序時，可以很方便地使用m13系列primers。w多克隆位點：ecor i, sac i, kpn i, sma i, bamh i, xba i, sal i, pst i, sph i 和hind iii 只有一個酶切位點。 w用途用途w克隆外源基因。 w利用lac promo

6、ter進行基因表達。 w使用m13 primers進行dna測序。 wpuc18/puc19 cloning site圖圖 w 三實驗方法三實驗方法w挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5ml lb培養(yǎng)液中（含amp 50g/ml）， 強烈搖蕩過度。w取1.5ml培養(yǎng)液至eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用ml ste懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。w將細菌沉淀懸浮于100l預(yù)冷溶液中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘。w加入200l溶液，蓋嚴管蓋輕柔顛倒次以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘。w加入150l溶液，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置分鐘。w12000g 4 離心分鐘，取上

7、清移到個新的eppendorf管中。 w(加入等體積酚/氯仿（：），振蕩混勻，12000g 4 離心分鐘。取上清移至另個eppendorf管中。)w加入倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。w g ,4 離心分鐘。w棄上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴管蓋顛倒數(shù)次，000g 于4 離心分鐘。w棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。w加入50l te（含20g/ml rna 酶，不含dna酶）溶解dna。 13取10l dna溶解液用稀釋至1000ul測定od260和od280,計算od260/od2 80之比；14. 同時以以下公式計算得率。質(zhì)粒dna得率：稀釋倍數(shù)od2600.0550/1.5ml15取10l dna溶解液加2l loading buffer于1%瓊脂糖,電泳3小時,電壓40伏。16電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結(jié)果。四結(jié)果分析四結(jié)果分析w質(zhì)粒dna od260,od280的值，由此計算質(zhì)粒dna得率和純度。w記錄