DNA印跡與雜交技術(shù)

1、第三節(jié)第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)一、一、 分子雜交的基本方法分子雜交的基本方法固相雜交固相雜交二、核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。的過(guò)程。 雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱(chēng)探針。已知核酸序列稱(chēng)探針。hybridization of nucleic acidsrnadna1dna2dnasouthernhybridizationnorthernhybridizatio

2、n探針探針一）一）dna變性與復(fù)性變性與復(fù)性 dna變性變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條dna鏈間的鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱(chēng)氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱(chēng)dna變性。變性。2、變性的方法：、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到）熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：）酸堿變性：ph值低于值低于3或高于或高于10時(shí)，雙鏈核時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈

3、間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加 復(fù)性復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱(chēng)復(fù)性或雜交。的過(guò)程，稱(chēng)復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：雙鏈：dna/dna、rna/dna、rna/rna、寡核苷酸寡核苷酸/dna和寡核苷酸和寡核苷酸/rna。2、復(fù)性過(guò)程、復(fù)性過(guò)程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈

4、）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離）局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列）局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子）形成完整的雙鏈分子 三、三、southern blotting dna印跡與雜交印跡與雜交 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的dnadna或或rnarna分子，都必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是分子，都必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)

5、地“吸印吸印”上去的，因此，核酸上去的，因此，核酸雜交也被稱(chēng)為雜交也被稱(chēng)為“dnadna印跡雜交印跡雜交”。材料：材料：尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、二乙氨基乙基纖維素濾膜（尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、二乙氨基乙基纖維素濾膜（deae）步驟：步驟：第一第一 將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上核酸印跡轉(zhuǎn)移核酸印跡轉(zhuǎn)移電泳凝膠核酸印跡法、電泳凝膠核酸印跡法、 斑點(diǎn)和狹線(xiàn)印跡法、斑點(diǎn)和狹線(xiàn)印跡法、 菌落和噬菌斑印跡法菌落和噬菌斑印跡法第二第二 是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的dna或或rna探針進(jìn)行雜交探

6、針進(jìn)行雜交 雜雜 交交 模模 式式 圖圖放射自顯影dna印跡轉(zhuǎn)移探針雜交（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組dnadna限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因dna片段片段x光底片光底片步驟解析步驟解析 bp1534 994 695 515 377 237 a b c m 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 凝膠置于凝膠置于naoh溶液中使溶液中使dna變性斷裂變性斷裂為較短的單鏈為較短的單鏈 dna，中性緩沖液中和凝膠中，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。的緩沖液。 4.1 固相支持物的選擇固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性）理想的固

7、相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng)不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機(jī)械性能具有良好的機(jī)械性能 非特異吸附少非特異吸附少4.2 常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本 底低。缺點(diǎn)是底低。缺點(diǎn)是dna分子結(jié)合不牢固分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈dna的能力比硝酸的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)活化膜

8、：優(yōu)點(diǎn)：dna與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的大小的dna片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低力較上述兩種膜低4.3 southern印跡的常用方法印跡的常用方法 （1）毛細(xì)管虹吸印跡法）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的dna轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的nacl和檸檬酸鈉，和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾

9、紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的凝膠中的dna片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的dna片段移出凝膠而滯留在膜上。片段移出凝膠而滯留在膜上。（2）電轉(zhuǎn)法）電轉(zhuǎn)法 利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的dna轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到固相支持物上。固相支持物上。（3）真空轉(zhuǎn)移法）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液

10、從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。 各種轉(zhuǎn)移方法的比較各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 毛細(xì)管虹吸法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)毛細(xì)管虹吸法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。）耗時(shí)多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特真空轉(zhuǎn)移法：

11、效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。殊真空轉(zhuǎn)移儀。轉(zhuǎn)移的最佳條件轉(zhuǎn)移的最佳條件 i) 固定基質(zhì)的選擇固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：dna和和rna分子變性，蛋白質(zhì)分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的則需除去凝膠中的sds。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移大分子的轉(zhuǎn)移對(duì)于分子量較大的對(duì)于分子量較大的dna片段，必須進(jìn)行片段，必須進(jìn)行原位斷裂原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂dna分子最佳長(zhǎng)度為分子最佳長(zhǎng)度為1-2kb。其步驟是：其步驟是： 0.25m hcl處理凝膠兩次（每次處理凝膠兩次（每次15分鐘）分鐘）水洗水洗0.5m naoh/1m nacl兩次，每次兩次，每次15分鐘

12、分鐘轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。 5、southern雜交雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與、預(yù)雜交：封閉膜上能與dna結(jié)合的位點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含dna探針的雜交液探針的雜交液 2、雜交：液相中的、雜交：液相中的dna探針與膜上的待測(cè)探針與膜上的待測(cè)dna雜交雜交 雙鏈雙鏈dna探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 dna 化學(xué)顯色或放射自顯影標(biāo)記的標(biāo)記的探針探針探針探針 探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)

13、的一種技能，我們把標(biāo)記的分子叫而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)的一種技能，我們把標(biāo)記的分子叫探針（探針（probe） 從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。如抗供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。如抗體體-抗體、外源凝集素抗體、外源凝集素-碳水合合物、親合素碳水合合物、親合素-生物素、受生物素、受體體-配基（配基（ligand）以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針）以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針-靶靶分子反應(yīng)。分子反應(yīng)。 （一）探針的種類(lèi)（一）探針的種類(lèi) 基因組基因組dna探針探針 cdna探針探針

14、 rna探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針（二）標(biāo)記物（二）標(biāo)記物理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性： 高度靈敏性高度靈敏性 不影響堿基配對(duì)的特異性不影響堿基配對(duì)的特異性 不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì) 對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大 檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性 標(biāo)記物種類(lèi)標(biāo)記物種類(lèi) 核素標(biāo)記物：核素標(biāo)記物：32p、35s、3h 非核素標(biāo)記物非核素標(biāo)記物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等

15、熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素酰化的堿性磷酸酶如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光可使發(fā)光底物發(fā)光 （三）標(biāo)記方法（三）標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記法：體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使 核素?fù)饺氲叫潞怂負(fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又校绾铣傻暮怂岱肿又?，?h-胸苷可摻入到胸苷可摻入到dna中，中， 3h-尿苷可摻入到尿苷可摻入到rna中中 體外標(biāo)記法：體外標(biāo)記法： 化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物

16、分子上的活性基因與 探針?lè)肿由系哪承┗蚍磻?yīng)，探針?lè)肿由系哪承┗蚍磻?yīng)， 標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由蠘?biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由?酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸 摻入到探針上摻入到探針上 酶促標(biāo)記法酶促標(biāo)記法切口平移法（切口平移法（nick translation)1、利用、利用dnase i在在dna雙鏈上造成單鏈切口雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌、利用大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i的的53 核酸外核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從切酶活性在切口處將舊鏈從5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在dna聚

17、合酶聚合酶i的的53 聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以互補(bǔ)的互補(bǔ)的dna單鏈為模板依次將單鏈為模板依次將dntp連接到切連接到切口的口的3 末端末端-oh上，合成新的上，合成新的dna鏈，同時(shí)鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的dna鏈中鏈中隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法 其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈dna模板結(jié)合，模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在作為合成新鏈的引物，在dna聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的dna鏈，其核苷酸序列與鏈，其核苷酸序列與模板模板dna完全互補(bǔ)。另一單鏈完全互補(bǔ)。另一單鏈dna模板同樣合成模板

18、同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的一條新的完全互補(bǔ)的dna鏈。合成時(shí)，帶放射性鏈。合成時(shí)，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的dna分子中分子中隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)：隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)：1、能進(jìn)行雙鏈、能進(jìn)行雙鏈dna、單鏈、單鏈dna或或rna探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記2、操作簡(jiǎn)單方便，避免因、操作簡(jiǎn)單方便，避免因dnasei處理濃度掌握不處理濃度掌握不當(dāng)所帶來(lái)的一系列問(wèn)題當(dāng)所帶來(lái)的一系列問(wèn)題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/gdna以以上上4、可直接在低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記、可直接在低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記（四）探針的純化（四

19、）探針的純化1、乙醇沉淀法：無(wú)水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：無(wú)水乙醇可以沉淀dna片段，可片段，可去除去除dntp和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)2、凝膠過(guò)濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將、凝膠過(guò)濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子大分子dna和小分子和小分子dntp、磷酸根離子及寡核苷、磷酸根離子及寡核苷酸（酸（80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是sephadex g-503、微柱離心法：其原理與上述凝膠過(guò)濾柱層析法相、微柱離心法：其原理與上述凝膠過(guò)濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來(lái)純化

20、探針?lè)▌t是利用離心的方式來(lái)純化探針 四、影響雜交的因素四、影響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度： 濃度越大，復(fù)性速度越快濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g，濃度過(guò)高影響雜，濃度過(guò)高影響雜 交效率交效率2、溫度：、溫度： （1）dna/dna雜交，適宜溫度較雜交，適宜溫度較tm值低值低2025 （2）rna/dna或或rna/rna雜交，加甲酰胺降低雜交，加甲酰胺降低 tm值值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較

21、）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較tm值低值低5 3、離子強(qiáng)度：、離子強(qiáng)度： （1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的）甲酰胺能降低核酸雜交的tm值，能降低雜交值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待液的溫

22、度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 雜交雜交 （2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在液在68雜交雜交 5、核酸分子的復(fù)雜性：、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長(zhǎng)度；的總長(zhǎng)度； （2）兩個(gè)）兩個(gè)dna樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于雜交率取決于dna的相對(duì)復(fù)雜性的相對(duì)復(fù)雜性 。6、非特異性雜交反應(yīng)：、非特異性雜交反應(yīng)： （

23、1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類(lèi)：即非特異性）常用的封閉物有兩類(lèi)：即非特異性dna和高分和高分子化合物。如鮭精子化合物。如鮭精dna或小牛胸腺或小牛胸腺dna，denharts溶液或脫脂奶粉。溶液或脫脂奶粉。 五、五、 其它分子雜交方法其它分子雜交方法固相雜交固相雜交（一）（一）northern印跡雜交印跡雜交 1、 northern blot印跡雜交是指待測(cè)印跡雜交是指待測(cè)rna樣品經(jīng)樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)

24、行固酸探針進(jìn)行固-液相雜交。液相雜交。 2、基本原理和基本過(guò)程與、基本原理和基本過(guò)程與southern blot基本相同基本相同 3、鑒別、鑒別rna 4、探針可用、探針可用dna或或rna片段片段 5、待測(cè)樣品為總、待測(cè)樣品為總rna或或mrna isolate mrna (different lengths) probe with labeled dnanorthern印跡與印跡與southern 印跡的不同點(diǎn)印跡的不同點(diǎn) 1、變性：、變性：rna電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持持rna處于變性狀態(tài)，處于變性狀態(tài)，dna電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：rna轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，southern 印跡時(shí)，印跡時(shí)，dna轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 3、靶核酸為、靶核酸為rna（二）斑點(diǎn)印跡雜交（二）斑點(diǎn)印跡雜交(dot bloting)特異性不高、不能鑒別核酸分子量特異性不高、不能鑒別核酸分子量（三）核酸原位雜交（三）核酸原位雜交(in situ hybridization) 由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)多色多色fish（m-fish技術(shù)）技術(shù)）熒光原位雜交熒光原位