質粒的提取與純化

1、實驗一 質粒的提取(堿法)1. 實驗目的2. 實驗原理 3. 實驗儀器、材料與試劑 4. 實驗步驟 5. 實驗結果及討論 實驗目的實驗目的l了解堿法提取質粒的原理；了解堿法提取質粒的原理；l掌握堿法提取質粒的方法。掌握堿法提取質粒的方法。實驗原理l質粒是一種細菌染色體外的、具有自主復制能質粒是一種細菌染色體外的、具有自主復制能力的、共價閉合環(huán)狀超螺旋結構的小型力的、共價閉合環(huán)狀超螺旋結構的小型dna分子。堿裂解法提取質粒是實驗室常用的方法。分子。堿裂解法提取質粒是實驗室常用的方法。l這種方法是根據共價閉合環(huán)狀質粒這種方法是根據共價閉合環(huán)狀質粒dna與線與線性染色體性染色體dna在拓撲學上的差異

2、來分離它們。在拓撲學上的差異來分離它們。結構的三大要素：結構的三大要素： 多克隆位點 選擇標記（耐藥性，lacz） 獨立的復制單位種類：種類： 質粒 噬菌體 酵母人工染色體（yac） 反轉錄病毒載體 表達載體等pbc sk mappbc sk mapt-載體在堿性條件（在堿性條件（ph 12.5）下，線性染色體）下，線性染色體dna的雙螺的雙螺旋結構解開而變性，質粒旋結構解開而變性，質粒dna的氫鍵雖然斷裂但兩的氫鍵雖然斷裂但兩條互補鏈彼此纏繞，緊密結合在一起。當加入乙酸鉀條互補鏈彼此纏繞，緊密結合在一起。當加入乙酸鉀恢復至中性時，染色體恢復至中性時，染色體dna分子難以復性，而質粒分子難以復

3、性，而質粒dna分子很快復性，離心時染色體分子很快復性，離心時染色體dna與細胞碎片與細胞碎片一起被沉淀出來，而質粒一起被沉淀出來，而質粒dna則留在上清液中。則留在上清液中。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質粒用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質粒dna。實驗儀器、材料與試劑實驗儀器、材料與試劑 （一）（一） 儀器儀器 1. 恒溫搖床 2. 超凈工作臺 3. 高壓滅菌鍋 4. 高速臺式離心機 5. 微量取液器 （二）（二） 材料材料 l含pbc ks質粒的大腸桿菌 dh 5。l含重組質粒的大腸桿菌 dh 5。（三）（三） 試劑試劑 l1. lb液體培養(yǎng)基（1l） 胰蛋白胨 10g

4、酵母提取物 5 g nacl 10 g 加去離子水至800ml 攪拌，使溶質完全溶解，用naoh調節(jié)ph值至7.0，加入去 離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20 分鐘。 llb固體培養(yǎng)基（1l） 在上述lb液體培養(yǎng)基（1l）中加入瓊脂粉15g。 l2. solution 50 mmol/l 葡萄糖 25 mmol/l tris.cl (ph 8.0) 10 mmol/l edta (ph 8.0) 高壓滅菌后，4保存?zhèn)溆谩?l3. solution(現用現配制) 0.2 mol/l naoh 1% sds 4. solution （100 ml） 5mol/l kac 60 ml 冰醋酸 1

5、1.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/l鉀鹽、5 mol/l醋酸 （ph 4.8）。 5. 氨芐青霉素（氨芐青霉素（amp） 用無菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存?zhèn)溆谩?6. 胰胰rna酶酶 l 將胰rna酶（rna 酶 a）溶于10 mmol/l tris.cl (ph 7.5)、15 mmol/l nacl中， 配成10 mg/ml的濃度，于100加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。 7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇 ，70%乙醇乙醇。實驗步驟 質粒的提取質粒的提取 l1. 用滅菌的牙簽挑取單菌落放入50ml lb液體培養(yǎng)基（含amp

6、0.1 mg/ml ）中，37振蕩培養(yǎng)過夜。 l2. 將菌液倒入1.5 ml eppendorf管中，10,000 rpm離心1min，去掉上清液，重復兩次。沉淀懸于200l solutioni 中, 渦旋使充分懸浮。 l3. 加入300l solutionii，混勻（注意動作輕），冰箱3 放置5min。 l4. 加入300l solutioniii,混勻（注意動作輕） ，冰箱3 放置5min。 l5. 12,000rpm，離心5min，將上清移至1個新eppendorf 管中，注意所取體積（約600 l ） 。 l6. 加入等體積氯仿（約600 l ），混勻（注意動作輕）。12,000rpm

7、，4，離心10min，取上清液。 l7. 上清液中加入預冷的等體積異丙醇，-20沉淀 2030 min。 l8. 12,000 rpm離心15 min。l9. 去上清，沉淀加入500l 70%乙醇洗滌2次（ 12,000 rpm離心3分鐘）。 l10. 去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。 l11. 每管中加入25l無菌水1l rnase， 37溶解質粒dna。lbiospin 質粒dna 小量提取試劑盒（實際用）實際用）l l操作過程操作過程l1. 將11.5ml 過夜培養(yǎng)的細菌菌液加入1.5ml 離心管中。l2. 于10，000rpm離心30 秒，并棄去上清液。l如有需要，可多

8、次重復步驟1、2，以收集更多細菌菌體。但勿過量，以免影響提取質粒的質量。l3. 加250l resuspension buffer，重懸細菌體沉淀。l重懸后應該沒有細菌團塊。l4. 加250l 細胞lysis buffer，輕柔顛倒46 次。l不要劇烈振動，以防止基因組dna 被剪切。注意不要讓反應持續(xù)超過5 分鐘。l5. 加350l neutralization buffer，立即輕柔顛倒離心管46 次。l溶液應該出現絮狀物，但不會出現局部沉淀。l6. 于13,000rpm離心10 分鐘。l如離心機轉速不夠可延長離心時間，直至形成緊密的白色沉淀。l7. 將步驟6 離心后得到的上清液轉移到sp

9、in column 內。于6,000rpm離心1 分鐘，并棄去接液管內液體。l8. 向spin column 內加650l wash buffer，于12，000g 離心3060 秒，并棄去接液管內液體。l9. 重復第8 步一次。l10. 再次于12，000rpm 離心1 分鐘，然后將spin column 轉移到無菌的1.5ml 離心管中。如不進行該步離心，則無法保證離心柱內殘液被徹底清除。l11. 向spin column 內加20l elution buffer、去離子水或te 溶液，并于室溫靜置1 分鐘。l可根據實驗的實際需要決定洗脫液用量。l12. 于12，000rpm離心1 分鐘，1.5ml 離心管內溶液中含有質粒dna。l13. 提取的質粒dna 可直接用于各類下游分子生物學