胚胎試驗在水生動物中的應用

1、胚胎試驗在水生動物中的應用李康2004.11.12建立靈敏、簡便易行的檢測方法 急性暴露試驗雖然簡便易行，但是其檢測指標過于簡單。 各種慢性毒性試驗雖然提供多個檢測終點，但存在實驗周期長、費用高等不足。 而水生生物胚胎試驗具有成本低、影響因素少、靈敏度高等方面的優(yōu)勢，受試物種也由最初的魚類向多樣化發(fā)展，其應用日益廣泛。 魚類成體和胚胎試驗靈敏度比較胚胎試驗 胚胎試驗是又稱胚胎毒性試驗或胚胎致畸試驗，指通過把胚胎暴露于受試化學物質而受到毒害作用，繼而影響胚胎的發(fā)育、導致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。 廣義上的胚胎試驗包括所有以胚胎為材料的生物學試驗，其內容涵蓋形態(tài)學、發(fā)育學、毒理學、行為學等方面 。

2、魚類 魚類因具有繁殖力高、體外產卵、體外受精等生殖特性成為胚胎試驗的最主要材料。拉丁名 通用名 文獻 oncorhynchus mykiss rainbow trout 1,2 danio rerio zebrafish 1 brachydanio rerio zebrafish 2 cyprinus caprio common carp 1,2 oryzias latipes medaka 1,2 pimephales promelas fathead minnow 1,2 carassius auratus goldfish 1 menidia peninsulae tidewater s

3、ilverside 1,2 lepomis macrochirus bluegill 1 clupea harengus herring 1 gadus morhua cod 1 cyprinodon variegates sheepshead minnow 1,2 oncorhynchus kisutch coho salmon 2 oncorhynchus tschawytscha chinook salmon 2 salmo trutta brown trout 2 salmo salar atlantic salmon 2 salvelinus fontinalis brook tro

4、ut 2 salvelinus namaycush lake trout 2 esox lucius northern pike 2 catostomus commersoni white sucker 2 lepomis macrochirus bluegill 2 ictalurus punctatus channel catfish 2 jordanella floridae flagfish 2 gasterosteus aculeatus three-spined stickleback 2 menidia menidia atlantic silverside 2 用于胚胎試驗的一

5、些種類斑馬魚 在實驗室內對單一物質的毒性評價往往使用特定的種類，斑馬魚是其中一個重要代表。歐洲和美國都有已經建立的標準方法。zebrafish (danio rerio)甲殼類 草蝦 草蝦屬廣鹽性甲殼動物 (3-31ppt)。 分布廣(遍布美國東海岸和墨西哥灣的廣大河口)。 個體小，只要水溫，光照條件適宜，成體在實驗室容易繁殖，只需分離不同發(fā)育階段的胚胎即可用于試驗。 盡管雌體產卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎離體后同樣可以正常發(fā)育至孵化， 卵外被膜、胚胎透明而易于觀察形態(tài)異常。grass shrimp (palaemonetes pugio)grass shrimp (palaemonetes

6、pugio)其它動物 the frog embryo teratogenesis assay-xenopus (fetax) 爪蟾 astm e 1563-98: standard guide for conducting static acute toscicity tests with echinoid embryos 海膽 medaka (oryzias latipes) blue crab (callinectes sapidus)試驗動物的選取 被廣泛利用 在實驗室內容易大量培養(yǎng) 具有代表性和對受試物的敏感性 遺傳背景清楚 試驗動物的飼養(yǎng)也有相應的規(guī)范胚胎來源 多數(shù)魚類產卵后離體孵化

7、，易于收集 。 一般可采用親魚人工催產結合人工受精的方法獲得 。 對于如斑馬魚，青鳉等小型種類，在實驗室內養(yǎng)殖相對容易，只需控制適當?shù)奈锢項l件，一般都能在試驗當天取到足夠數(shù)量的受精卵 。野外試驗 收集魚卵 在實驗室完成剩余的發(fā)育過程，檢測多個終點指標 。 原位暴露 在室內得到受精卵，用適當?shù)难b置放置于待檢測的地點，全部發(fā)育過程或絕大部分發(fā)育過程在野外完成。 有抱卵習性的甲殼動物，胚胎在母體腹部附肢發(fā)育成幼體，通過捕撈帶卵的母體，分離胚胎。分類 胚胎試驗同樣可分成急性毒性試驗和亞急性毒性試驗 。 急性毒性試驗時間較短，其目的是獲得有關受試物的初步毒性信息；亞急性毒性試驗時間較長，可以貫穿胚胎發(fā)育

8、的整個時期。 暴露途徑 可分為靜態(tài)，半靜態(tài)和流動等 ，或微注射的途徑。 容器 透明的試驗容器通常是首選，燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管是最普通的工具。 在野外暴露試驗中，有黏性的受精卵可以被直接負在載玻片上，后者固定在特制的容器里 。溶劑 有機物質水溶性較差，則需要化學溶劑來助溶，但不適當?shù)娜軇绊懡Y果的可靠性，化學溶劑本身對胚胎具有毒性甚至會和受試物產生協(xié)同作用，因此，選用適當?shù)娜軇┮约斑m當?shù)臐舛葘Y果的準確性都是有益的。 乙醇，丙酮，二甲亞砜是常用的溶劑，終濃度一般在0.1%以下 。0.5%(v/v)乙醇1%(v/v)乙醇對照grass shrimp (palaemonetes pugio)檢測終

9、點 半致死濃度（lc50） 形態(tài)異常 孵化延遲 生化指標 遺傳物質 生長指標半致死濃度（lc50） 半致死濃度（lc50） 死亡是檢測的可見終點，初步反映受試物的毒性，是急性毒性試驗的常用指標 。 孵化也可作為終點來反映受試物毒性，指標采用半效應濃度（ec50）。 在發(fā)育早期可以胚胎完整性來判斷存活與否，當器官出現(xiàn)后則用器官的運動作為標準。 形態(tài)異常 形態(tài)異常是胚胎致畸試驗的核心內容 。 斑馬魚和爪蟾胚胎發(fā)育過程中有多種可以觀察的反應指標，被列入標準方法的觀察終點。 對于甲殼動物，常見的觀察結構有眼、卵黃形狀、心臟、頭部、肝胰腺 。 發(fā)育異常往往會導致導致終止發(fā)育或發(fā)育延遲，進而推遲孵化時間。

10、 b = brain; c = chorda; ch =chorion; e = ear; ed = edema; eud = ear underdeveloped; ey = eye; eyud= eye underdeveloped; nc = negative control; tnd = tail not detached;woey = without eyes; woh = without head; wos = without somitescatfish (clarias gariepinus) 對照 cd 和cu1%(v/v)乙醇對照grass shrimp (palaemon

11、etes pugio)孵化延遲grass shrimp (palaemonetes pugio)生化指標 隨著胚胎發(fā)育的深入，器官逐漸建成，一些酶活性也顯示出來，在暴露條件下酶活性的改變也可作為檢測終點；受試物既可抑制酶活性，也可使一些酶出現(xiàn)應激性增強 。grass shrimp (palaemonetes pugio)受試物及其代謝物還可能對遺傳物質產生影響 grass shrimp (palaemonetes pugio)生長指標catfish (clarias gariepinus)pacfic herring (clupea pallasi)應用現(xiàn)狀 單一化學品毒性 環(huán)境檢測項目 檢測

12、土壤、沉積物污染 。 石油降解產物；溢油事件的生態(tài)恢復研究 。 混合性工業(yè)生產廢水，生活污水的毒性，特別是致畸效應，被用于探討遺傳毒性。 名稱 拉丁名 污染物 文獻 inland silverside pacific herring sturgeon mummichog rainbowfish surf smelt fathead minnows medaka grunion carp flagfish pacific herring medaka fathead minnows rainbow trout catfish medidia beryllina clupea harengus o

13、ryzias latipes clupea harengus oncorhynchus mykiss 石油及降解產物 殺蟲劑及除草劑 有機物 重金屬 7 8,80 9 10 11 13 30 59，60，68 62 35 38 28 44 48 67 23 分類 化合物 終點 參考文獻 抗真菌劑 石油 重金屬 殺蟲劑 有機化合物 chlorothalonil copper chromium aluminum methoprene endosulfan chlorpyrifos malathion fipronil anthracene pyrene -terthienyl methylene blue 2-methyl-1,4-naphthoquinone 4-nitroquinoline-n-oxide ethanol dimethylsulfoxide acetone 1 19 19，64 51 51 57 64 17,18 17,18 17,18 17,18 55 55 發(fā)展