全血DNA的提取及電泳ppt課件

1、DNA的提取及電泳2013.03.301;.21.實 驗 原 理DNA一、全血DNA的提取34由于血液各組分成分顆粒大小及比重不同，利用明膠的吸附作用，使紅細胞沉積由于血液各組分成分顆粒大小及比重不同，利用明膠的吸附作用，使紅細胞沉積在管底，從而與白細胞相分離。在管底，從而與白細胞相分離。通過通過SDS的破膜（細胞膜和核膜）作用，使白細胞釋放出的破膜（細胞膜和核膜）作用，使白細胞釋放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提純化，分離去除蛋白質(zhì)。然后利用酚和氯仿抽提純化，分離去除蛋白質(zhì)。最后用乙醇沉淀洗出最后用乙醇沉淀洗出DNA。52.材料與方法. .材料材料用含抗凝劑的采血管進行采血，抗凝劑一般有用含抗

2、凝劑的采血管進行采血，抗凝劑一般有EDTAEDTA和肝素，和肝素，EDTAEDTA更好一些，不更好一些，不會影響下游的反應(yīng)。會影響下游的反應(yīng)。每每5ml5ml的血液中加入的血液中加入0.4ml 0.04M EDTA0.4ml 0.04M EDTA配好的配好的EDTAEDTA溶液，顛倒混勻即可。溶液，顛倒混勻即可。保存于保存于-20-20至至-80-80，最好在，最好在2 2個月內(nèi)提取。個月內(nèi)提取。 63%明膠，明膠，TES， Tris飽和酚（飽和酚（pH7.8），氯仿：異戊醇（），氯仿：異戊醇（24:1），無水乙），無水乙醇，醇，TE離心機，離心機，7ml離心管，離心管，1.5mlEP管，中試

3、管，移液器管，中試管，移液器7方法： 提取WBC取1ml 全血等體積3%明膠37靜置，510min取上清3000r/min 離心 ，5min棄上清顛倒混勻溶液顏色均一溶液顏色上下分層沉淀顏色為紅色8 破碎WBC加入2ml TES加10滴10%SDS輕輕敲擊管底震蕩混勻顛倒混勻溶液全部變?yōu)榉奂t色溶液顏色變暗9 抽提DNA加等體加等體積積Tris飽飽和酚和酚顛倒混勻，50次， 3000rpm，離心5min取下層酚溶液，混勻后溶液變?yōu)榫坏淖厣∩锨迦∩锨寮拥润w加等體積積氯仿：異戊氯仿：異戊醇（醇（24:1）將上清移入試管將上清移入試管顛倒混勻，50次3000rpm，離心5min混勻后溶液變?yōu)榫坏?/p>

4、乳白色上清夜（DNA）蛋白質(zhì)層 酚溶液上清夜（DNA）蛋白質(zhì)層 氯仿溶液10 沉淀DNA加2.5倍無水乙醇吸出絮狀沉淀到1.5mlEP管揮干至無色液體通風櫥內(nèi)放置5min加入100 ddH2O溶解緩慢加入后，上下均為無色，但有分層面；吸取上層乙醇，輕輕吹打下層（油狀）混勻。無水乙醇與水溶液交界面特點： 1.氣泡 2.白色絮狀沉淀11二、瓊脂糖凝膠電泳二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定以及純化DNA或者RNA分子的方法。這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。1.原理12電泳介質(zhì) 瓊瓊脂糖是一種天然聚合脂糖是一種天

5、然聚合長鏈長鏈狀分子，是由狀分子，是由D型和型和L型半乳糖以型半乳糖以-1， ，3和和-1， ，4糖苷糖苷鍵鍵相相連連形成的形成的線線狀高聚物。沸水中溶解，狀高聚物。沸水中溶解，45 開始形成多孔性開始形成多孔性剛剛性性濾濾孔，凝膠孔徑的大小（孔徑范孔，凝膠孔徑的大小（孔徑范圍圍從從50nm到大于到大于200nm）決定于）決定于瓊瓊脂糖的脂糖的濃濃度。度。13.DNA分子的電荷效應(yīng)： DNA在高于其等在高于其等電電點的溶液中點的溶液中帶負電帶負電，在，在電場電場中向陽極移中向陽極移動動。 。DNA帶凈電帶凈電荷量的多少與荷量的多少與電電流流強強度，度，電電泳泳緩緩沖液的沖液的pH值值和離子和離

6、子強強度有關(guān)度有關(guān)。14. DNA瓊脂糖電泳的分子篩效應(yīng)： 在一定的在一定的電場強電場強度下，度下，DNADNA分子的遷移速度取決于分子分子的遷移速度取決于分子篩篩效效應(yīng)應(yīng)，即分子本身的大小、構(gòu)型和，即分子本身的大小、構(gòu)型和瓊瓊脂糖的脂糖的濃濃度是主要的影響因素。度是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。分子的遷移速度與其相對分子量成反比。M 1 2 3 4 51516瓊瓊脂糖脂糖的的濃濃度度17示蹤染料：示蹤染料： 有致癌性有致癌性: EB， ，吖啶吖啶橙等橙等; 無毒的染料：無毒的染料：goldview I核酸染料等核酸染料等.示蹤染料和分子量示蹤染料和分子量標標準參照

7、物準參照物EBgoldview18 分子量分子量標標準參照物（準參照物（Marker） ）19實驗實驗材料：材料： 全血基因全血基因組總組總DNA. .實驗試劑實驗試劑： ：瓊瓊脂糖脂糖5TAE電電泳泳緩緩沖液沖液6電電泳泳載樣緩載樣緩沖液（沖液（ 6 loading dye）：）： 0.25 溴酚溴酚藍藍， ，0.25% 二甲苯青，二甲苯青，40(w/v) 蔗糖水溶液，蔗糖水溶液，貯貯存于存于 4。 。goldview I型核酸染料：型核酸染料： 每每10 l DNA加入加入2 l染料。染料。3. 3. 實驗材料和試劑實驗材料和試劑20.實驗儀實驗儀器器21凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)224.

8、操作步驟. .制膠制膠 1.0% 1.0% 瓊瓊脂糖凝膠，脂糖凝膠，0.50.5TBETBE. .上上樣樣 上上樣緩樣緩沖液沖液. .電電泳泳 100V100V， ，20min20min. .觀觀察察 紫外燈下紫外燈下觀觀察察溶溶 膠膠23;.上樣準備DNA: 8l6loading dye: 2lTotal : 10l 分別吸取上述體積的DNA和6loading dye，至透明膠布的光滑表面，用移液器吹打均一。24;.凝膠冷卻至凝膠冷卻至50，加，加goldview I 2 l搖搖勻勻25;.凝膠凝固后取出梳子凝膠凝固后取出梳子26;.加加緩緩沖液沖液27;.準準備樣備樣品品28;.點點 樣樣29;.電電 泳泳30;.注意注意觀觀察溴酚察溴酚藍藍染液的遷移染液的遷移31;.紫外燈下紫外燈下觀觀察察電電泳泳結(jié)結(jié)果果32;.照照 相相33;.34制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易