第六章植物的花藥與花粉培養(yǎng)

1、20 20 第六章第六章 植物花藥和花粉培養(yǎng)植物花藥和花粉培養(yǎng)第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)的意義花藥和花粉培養(yǎng)的意義 花藥是植物花的雄性器官，包括體細胞性質的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細胞的花粉粒。按染色體的倍性來看，前者為二倍體細胞，后者為單倍體細胞。 因此，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花粉培養(yǎng)屬細胞培養(yǎng)，但花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導花粉細胞發(fā)育成單倍體細胞，最后發(fā)育成單倍體植株。一、花藥和花粉培養(yǎng)的概念一、花藥和花粉培養(yǎng)的概念 1. 花藥培養(yǎng)的概念：是指將花粉發(fā)育到一定花藥培養(yǎng)的概念：是指將花粉發(fā)育到一定階段的完整花藥接種到培養(yǎng)基上，誘導形成階段的完整花藥接種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍

2、體再生植株的技術。單倍體再生植株的技術。 2. 花粉培養(yǎng)的概念：是指將離體的花粉粒接花粉培養(yǎng)的概念：是指將離體的花粉粒接種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株的種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株的技術。技術。二、二、 花藥和花粉培養(yǎng)的意義花藥和花粉培養(yǎng)的意義n 研究減數(shù)分裂，花粉生長機制的生理、生化、遺研究減數(shù)分裂，花粉生長機制的生理、生化、遺傳等基礎理論的最好方法傳等基礎理論的最好方法 n 快速獲得純合二倍體植株（純系）快速獲得純合二倍體植株（純系）n 有利于盡早淘汰隱性的有害個體，篩選出具有優(yōu)有利于盡早淘汰隱性的有害個體，篩選出具有優(yōu)良性狀的個體良性狀的個體第二節(jié)第二節(jié) 單倍體的概念及發(fā)生

3、方式單倍體的概念及發(fā)生方式一、植物單倍體的概念一、植物單倍體的概念 1、單倍體（haploid）： 指具有配子體染色體組的孢子體。 2、單倍體細胞： 具有體細胞一半染色體的細胞。 3、單倍體植株： 單倍體細胞在離體條件下進行培養(yǎng)，使其發(fā)育成植株。 二、單倍體的發(fā)生方式二、單倍體的發(fā)生方式n孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵細胞發(fā)育成胚，進一步發(fā)育成單倍體植物。n孤雄生殖：在傳粉后卵細胞退化消失，由精細胞單性發(fā)育成為單倍體植物。n無融合生殖：由胚囊中卵細胞以外的其它細胞，發(fā)育成的單倍體植株。如反足細胞、助細胞等。n人工誘發(fā)單倍體： 途徑：a.1966年前: 人工生產(chǎn)單倍體方法，有激素處理、遠緣雜交、延

4、遲受粉、用照射花粉授粉。b.目前: 離體花粉或花藥培養(yǎng)，誘發(fā)小孢子單性發(fā)育成單倍體植物。離體培養(yǎng)未受精的子房和胚珠，誘導卵細胞單性發(fā)育成植物體。三、單倍體育種的應用 縮短育種年限，加速f1代雜合體的純化。利用單倍體易于檢測突變和恢復重組，發(fā)現(xiàn)隱性突變體，研究遺傳分析的良好技術。對于二倍體植物加倍變成四倍體或倍數(shù)更高的多倍體，可以改善原來植物的某些經(jīng)濟性狀，滿足人類的要求。對異花授粉植物的單倍體植株進行加倍，可迅速獲得自交系，免去人工自交的過程，節(jié)省大量的時間和人力。 第三節(jié)第三節(jié) 植物花藥與花粉培養(yǎng)植物花藥與花粉培養(yǎng)一、概念 花藥與花粉培養(yǎng)： 以離體的花藥或花粉為外植體, 在人工培養(yǎng)基中,使其

5、發(fā)育成完整植株的技術。 目的：誘導產(chǎn)生單倍體植株。 雄蕊結構： 花藥是花的雄性器官。包括花絲、花藥兩部分。其中花藥部分由藥隔（2n）和花粉粒(1n)組成。 花粉粒（也稱小孢子）是由花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成。它的染色體數(shù)目為體細胞的一半，為單倍體細胞。各種植物的花粉粒表面結構各種植物的花粉粒表面結構圖 花藥與花粉培養(yǎng)與單倍體植物的形成二、 影響花粉培養(yǎng)的因素1 花粉發(fā)育時期對花粉培養(yǎng)的影響 花粉發(fā)育時期是否合適，是花藥培養(yǎng)成功的關鍵。大多數(shù)單核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或愈傷組織。 培養(yǎng)花藥之前，需要制片鏡檢，確定花粉發(fā)育時期。進 行細胞學花粉發(fā)育時期的鏡檢。（1）低溫度處理： nitsc

6、h（1973）發(fā)現(xiàn)低溫處理可以明顯提高花粉胚的誘導率，3下保存48h，然后花藥接種，花粉胚的誘導率提高了33.6%。低溫處理對農(nóng)作物花藥培養(yǎng)同樣有效。煙草花藥79下714d為宜；水稻處理10、48h；小麥和黑麥需在13下220d得到良好效果。（2）離心處理tanaka（1973）將單核后期的煙草花藥在1000011000r/min的速度下離心30min，產(chǎn)生小植株的頻率從30.5%提高38.2%，每個花藥產(chǎn)生的小植株數(shù)目從對照的平均1.6株提高到5.4株。（3）乙烯處理 bennett和hughes(1972)在研究小麥化學去雄時注意到，在減數(shù)分裂前用乙烯利噴施植株，促使花粉細胞核發(fā)生分裂。王

7、敬駒（1979）在培養(yǎng)基中及植株上分別施加乙烯利，結果發(fā)現(xiàn)在小麥花藥培養(yǎng)基中較低濃度的乙烯利（4080ppm）對花粉的愈傷組織的形成有促進作用。三、 花藥和花粉培養(yǎng)技術1花藥培養(yǎng) 將發(fā)育到一定階段的花藥，培養(yǎng)在人工合成的培養(yǎng)基上，使花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育途徑發(fā)生改變，形成花粉胚或花粉愈傷組織，隨后由胚狀體或愈傷組織分化成植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)產(chǎn)生的花粉植株一般有兩條途徑：a.花藥中的花粉通過胚狀體階段發(fā)育為小植株，例如煙草、曼佗羅等。b.花粉在誘導培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再誘導分化植株。2、花粉培養(yǎng) 從花藥中游離出花粉粒，通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化啟動發(fā)育為單倍體植株的技術。 特點: 它可以避免花藥壁、藥隔及

8、花絲等體細胞愈傷組織的干擾，可以獲得大量的花粉植株。1）花粉的分離與純化：分離法：自然散落法、擠壓法、機械游離法（磁力攪拌）純化：用不同孔徑的無菌篩子除雜。2）花粉培養(yǎng)的方式：平板培養(yǎng)：花粉在固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使其形成花粉胚狀體，最終分化為植株。液體培養(yǎng): 懸浮培養(yǎng)，通氣性差。雙層培養(yǎng)：上-液體+下-固體看護培養(yǎng)：花粉-濾紙-固體培養(yǎng)基 條件培養(yǎng)基：在花藥培養(yǎng)基中加入失活的花藥提取物。 采用看護培養(yǎng)法：采用看護培養(yǎng)法： 無菌條件下，將花藥接種在固體培無菌條件下，將花藥接種在固體培養(yǎng)基上養(yǎng)基上在每個花藥上覆蓋一小塊圓片濾紙在每個花藥上覆蓋一小塊圓片濾紙 用移液管吸用移液管吸取取l滴滴 每毫升

9、含每毫升含10個花粉粒的懸浮液接種在濾紙中央個花粉粒的懸浮液接種在濾紙中央形形成胚狀體成胚狀體分化為單倍體植株。分化為單倍體植株。 由于完整的花藥發(fā)育過程釋放出有利于花粉發(fā)育的物質，并通過濾紙供給花粉，促進了花粉的發(fā)育。 四、花粉植株的倍性1 誘導單倍體植株的倍性 1) 花藥培養(yǎng)形成單倍體植株。但花藥中的藥壁、藥隔等為二倍體組織也可能被誘導發(fā)育成植株。 2）經(jīng)染色體組型分析，花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有非單倍體植株的存在。 3）激素對倍性變化有很大影響。 通過胚狀體產(chǎn)生的花粉植株，幾乎都是單倍體。而經(jīng)過愈傷組織產(chǎn)的花粉植株中不少是二倍體。愈傷組織繼代培養(yǎng)時間愈長，二倍體的比例愈高。2 單倍體植株的染色體加

10、倍1）人工誘導染色體加倍常用化學誘導方法，有秋水仙素、富民農(nóng)、對二氯苯、8-羥基喹啉等。2）秋水仙素是由地中海生長的一種百合科植物秋水仙的種子和球莖提取出來的物質。能溶于水、酒精，可阻止細胞有絲分裂時紡錘絲的形成。 （1）小苗浸泡加倍：雙子葉植物煙草用0.4%秋水仙素溶液處理48h，加倍率為35%。 （2）頂芽或腋芽處理加倍：將適宜濃度的秋水仙素水溶液，或調和在載體羊毛脂中，處理植株的頂芽或腋芽，誘導其分生組織的加倍。 （3）培養(yǎng)基加倍：用單倍體植株的營養(yǎng)體置于一種適當?shù)呐囵B(yǎng)基上，誘導形成愈傷組織，然后再放到分化培養(yǎng)基上，再生植株。五、例子：小麥花藥培養(yǎng)程序 1、取材：用醋酸洋紅涂片鏡檢，選取

11、小孢子處于單核中期的 麥穗，外部形態(tài)為：旗葉葉耳與其下一葉的葉耳距為5-15厘 米。 2、預處理：將穗子用濕紗布包好，放在塑料袋中，置于3- 5冰箱中預處理3-5天。 3、接種：70%表面消毒，將葉鞘剝除，無菌條件下，將穎殼上端1/3剪掉，鑷子將花藥輕輕拿出，接種到：n6+2，4-d（2mg/l）+kt(0.5mg/l)+蔗糖10%，溫度25，暗中培養(yǎng)。 4、分化：愈傷組織1-2毫米時，轉入分化培養(yǎng)基中，n6+2naa（0.5mg/l）+kt(0.5mg/l)+蔗糖3%，溫度25，光照10h/d. 5、移栽：2周后，出根、芽。當花粉植株長到2-3個真葉時，可轉入1/2ms培養(yǎng)基中。低溫弱光下練

12、苗后可移栽于大田或溫室中。六、單倍體植株的應用六、單倍體植株的應用n染色體加倍在植物育種中有重要的意義。染色體加倍在植物育種中有重要的意義。n1 1單倍體植株的染色體加倍，可形成純合的二倍體，恢復植物育性，縮短新單倍體植株的染色體加倍，可形成純合的二倍體，恢復植物育性，縮短新品種的選育周期；由于以花藥培養(yǎng)可得到大量的倍體植株。因此成為單倍體品種的選育周期；由于以花藥培養(yǎng)可得到大量的倍體植株。因此成為單倍體育種的有利工具，用花藥培養(yǎng)進行單倍體育種的優(yōu)點是縮短育種年限，加速育種的有利工具，用花藥培養(yǎng)進行單倍體育種的優(yōu)點是縮短育種年限，加速f1f1代雜合體的純化。代雜合體的純化。n2 2對于二倍體植

13、物加倍變成四倍體或倍數(shù)更高的多倍體，可以改善原來植物對于二倍體植物加倍變成四倍體或倍數(shù)更高的多倍體，可以改善原來植物的某些經(jīng)濟性狀。的某些經(jīng)濟性狀。n3 3對異花授粉作物（如玉米）的單倍體植株進行加倍，可迅速獲得自交系，對異花授粉作物（如玉米）的單倍體植株進行加倍，可迅速獲得自交系，免去了煩瑣的人工自交過程，節(jié)省大量的時間和人力。免去了煩瑣的人工自交過程，節(jié)省大量的時間和人力。n4 4排除顯隱性基因干擾，有利于進行突變體選擇：突變一般為隱性突變，隱排除顯隱性基因干擾，有利于進行突變體選擇：突變一般為隱性突變，隱性突變在二倍體中表現(xiàn)機會極低。對于一對雜合基因（性突變在二倍體中表現(xiàn)機會極低。對于一

14、對雜合基因（a-aa-a）而言，雜合體種）而言，雜合體種子繁殖后代中顯性純合體子繁殖后代中顯性純合體aaaa和隱性純合體和隱性純合體aaaa出現(xiàn)概率出現(xiàn)概率1/41/4，而單倍體純合出，而單倍體純合出現(xiàn)概率現(xiàn)概率1/21/2。如為。如為n n對雜合等位基因，單倍體育種比常規(guī)育種選擇效率提高對雜合等位基因，單倍體育種比常規(guī)育種選擇效率提高2n2n倍。倍。n例如，煙草例如，煙草“早育早育1 1號號”，19711971年從雜交的年從雜交的f1f1植株上取下植株上取下花藥進行培養(yǎng)，植株加倍，當年獲得種子。花藥進行培養(yǎng)，植株加倍，當年獲得種子。19721972年播年播6666株株純合二倍體煙草種子，進行純合度鑒定，從中選出兩個較純合二倍體煙草種子，進行純合度鑒定，從中選出兩個較好株系。好株系。19731973年在大田中進行生產(chǎn)示范，經(jīng)全國會議現(xiàn)場年在大田中進行生產(chǎn)示范，經(jīng)全國會議現(xiàn)場鑒定，正式確定為煙草新品種，總共經(jīng)四年時間就育成了鑒定，正式確定為煙草新品種，總共經(jīng)四年時間就育成了新品種。新品種。n中國農(nóng)科院李梅芳水稻品種的中花中國農(nóng)科院李梅芳水稻品種的中花8 8號、號、9 9號等累積推