凝膠過濾層析法分離血紅蛋白

1、凝膠過濾層析法分離血紅蛋白凝膠過濾層析法分離血紅蛋白化學生物學實驗藥學院藥學院 化學生物學教研室化學生物學教研室1.實驗目的實驗目的 1 22.實驗原理實驗原理 層析法是利用混合物中各組分物理經(jīng)學性質的差別（如吸附力、溶解度、分子形狀、大小和極性等），使各組分以不同的程度分布在兩相中，從而使各組分以不同的速度隨流動相向前流動而達到分離的目的。層析法可分為多種類型，包括分配層析，離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等。 層析法層析法分配層析分配層析 離子交換層析離子交換層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析 親和層析親和層析 2.實驗原理實驗原理1 1待分離混合物（a、b）隨流動相通過固定相由于理化性質差

2、異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，移動速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的2 23 34 4凝膠過濾層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小及形狀不同，在通過凝膠（固定相）時，分子的擴散速率各異而達到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性的網(wǎng)狀結構，小分子可以進入凝膠顆粒內部，流程長而移動速率慢（阻滯作用大）；而大分子則被排除在外，沿凝膠間空隙隨（流動相）流動，流動短而移動速率快（阻滯作用小），比小分子物質先流出層析床，所以凝膠過濾層析又稱為排阻層析，分子

3、篩層析，凝膠過濾法操作簡例，且操作條件溫和，不易引起生物樣品變性失活，分離效果好，故廣泛應用于蛋白質、酶、核酸的分離提純（包括脫鹽、濃鹽及分子量的測定等）2.實驗原理實驗原理本實驗通過本實驗通過sephadexg50層析柱，以蒸餾水為流動相，分離血紅蛋層析柱，以蒸餾水為流動相，分離血紅蛋白（紅色，分子量約白（紅色，分子量約64,500）與二硝基氟苯）與二硝基氟苯-魚精蛋白（魚精蛋白與魚精蛋白（魚精蛋白與二硝基氟苯結合后為黃色，分子量為二硝基氟苯結合后為黃色，分子量為2,000-12,000）的混合物，從顏）的混合物，從顏色的不同即可觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。色的不同即可觀察到血

4、紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。2.實驗原理實驗原理3.實驗用品實驗用品 4.操作步驟操作步驟1 1、凝膠準備：、凝膠準備：取sephadex g-50 3g置于錐形瓶中，加蒸餾水90ml，于沸水浴中煮沸2小時(或放于水中浸泡6小時)，充分膨脹凝膠。取出，冷卻至室溫后備用。2 2、裝柱：、裝柱：關閉下口，向玻璃柱內加入蒸餾水達柱總長度約1/3處，把膨脹好的糊狀凝膠邊攪拌、邊自柱的頂端沿管內壁緩緩加入柱中至柱頂部，待柱底部凝膠沉積至1-2cm時，開啟柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。再慢慢地繼續(xù)加入凝膠，直至凝膠體積至柱頂2.5cm左右，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，

5、需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長度至少8cm。最后放入略小于層析柱內徑的圓形小濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。4.操作步驟操作步驟3 3、平衡：、平衡：用10ml左右的蒸餾水流洗整個柱床。操作過程中嚴防出現(xiàn)氣泡和分層，如床面不平，可用玻璃棒輕輕攪動表面，是凝膠重新自然沉降。整個過程中勿使液面低于床面，以免氣體進入，使柱床干裂。4 4、加樣：、加樣：待柱床面以下的蒸餾水流出，且剛好與床面相切時(切不可使床面完全暴露于空氣中)，關閉下口。用滴管取血紅蛋白及魚精蛋白混合液（血紅蛋白稀釋液3滴加dnp-魚精蛋白溶液3滴），十分小心地并緩緩沿內壁加入(注意切勿破壞柱床面)，打開柱底

6、部出口，使樣品進入床內，至床面重新露出時，先加入少量的蒸餾水，沖洗床面1-2次，然后再加入足量蒸餾水。4.操作步驟操作步驟5 5、洗脫和標定：、洗脫和標定：用試管收集洗脫液體。調節(jié)流速使液體均勻流出（約1ml/min），同時記錄如下數(shù)據(jù)：起始、紅始、紅終、黃始、黃終、終止(1.5倍柱體積)。觀察血紅蛋白與魚精蛋白的洗脫次序并記錄實驗現(xiàn)象(注意洗脫過程中隨時添加蒸餾水，以免干柱)。6 6、清洗：、清洗：待所有色帶流出層析柱后，繼續(xù)加入蒸餾水并加快流速，清洗層析柱至凝膠潔凈呈白色為止。7 7、凝膠的回收：、凝膠的回收：將清洗干凈的sephadex g-50凝膠回收至回收容器中。8 8、結果處理：、

7、結果處理：觀察記錄實驗現(xiàn)象并加以分析。5.注意事項注意事項膠膨脹必須徹底，否則會影響層析的均一性，甚至有使柱破裂的危險。裝柱前加入1cm洗脫液，檢查柱子。凝膠裝柱過程中嚴防出現(xiàn)氣泡和分層，要使液面高于床面，以免氣體進入柱床，影響液體在柱內的流動與最終血紅蛋白及核黃素混合物質的分離效果。凝膠裝柱要一次完成。裝凝膠的燒杯不能清洗。（看似臟的東西都是凝膠）。柱中的凝膠一定要浸沒在洗脫液中。加樣一定要極其小心而緩慢，以免凝膠被沖起，造成層析結果不佳。上樣時滴管末端一定要靠近凝膠柱表面(1cm)、沿柱內壁緩緩滴加，不能沖擊凝膠柱表面。樣品上柱后應在凝膠柱表面形成一層薄液層。收集要及時，不能等紅褐色物質流

8、出之后再收集(13滴/管)。流速不可太快(約10滴/min)。層析前及層析中要絕對避免干柱現(xiàn)象。始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變壞，不得不重新裝柱。洗脫完成后凝膠要回收，勿丟棄。6.思考題在向凝膠柱加入樣品時，為什么必須保持膠面平整？上樣體積在向凝膠柱加入樣品時，為什么必須保持膠面平整？上樣體積為什么不能太大？為什么不能太大？請解釋為什么在洗脫樣品時，流速不能太快或者太慢？請解釋為什么在洗脫樣品時，流速不能太快或者太慢？某樣品中含有某樣品中含有1 mg a蛋白（蛋白（mr 10,000da），），1 mg b蛋白蛋白（mr 30,000da），），4 mg c蛋白（蛋白（mr 60,000da），），1 mg d蛋白