基因工程第六章1

1、第六章第六章 重組體克隆的重組體克隆的篩選與鑒定篩選與鑒定 由dna分子的體外重組，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等適當途徑引入宿主，會得到大量的重組體細胞或噬菌體。在這些眾多的重組體中，會有多種類型的dna分子，包括：不帶任何外源dna插入片段，僅由線性載體分子自身連接形成的環(huán)狀dna分子；由一個載體分子和一個或數(shù)個外源dna片段構(gòu)成的重組體dna分子；單純由數(shù)個外源dna片段彼此連接形成的多聚dna分子。 對于這些由混合的dna制劑轉(zhuǎn)化而來的大量的克隆群體，需要采用特殊的方法，才能選擇和鑒定出可能含有目的基因的重組體克隆。目前已發(fā)展和應(yīng)用了一系列重組體克隆檢測法，包括遺傳檢測法、物理檢測法、使用特異

2、性探針的核酸雜交法，以及免疫化學法等。 6.1 利用表型特征選擇（遺傳檢測法）利用表型特征選擇（遺傳檢測法） 表型是指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。這里所說的供篩選用的表型特征來自兩個方面：一個是克隆載體提供的，另一方面是插入的外源dna序列提供的，前者應(yīng)用較多。 6.1.1 利用載體提供的表型特征選擇重組體分子利用載體提供的表型特征選擇重組體分子 1. 抗藥性標記插入失活選擇法抗藥性標記插入失活選擇法 檢測外源dna插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。例如在pbr322質(zhì)粒的dna序列上，編碼有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)，且在tetr基

3、因內(nèi)有bam hi和sal i兩種限制酶的單一切點。在這兩個識別位點中的任何插入作用，都會導(dǎo)致tetr基因出現(xiàn)功能性失活，因而根據(jù)amprtets表型即可篩選出在tetr基因內(nèi)帶有插入dna片段的重組體細胞。 利用環(huán)絲氨酸富集法可以簡化這種插入失活檢測法的程序，該法可以使那些只帶有原來質(zhì)粒載體的細菌致死，從而抑制不含有插入dna片段的載體分子形成轉(zhuǎn)化子。例如： 當外源dna 插入在pbr322質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tetr)上，該基因便會立即失去它的功能作用，而另一種抗菌素抗性基因氨芐青霉素基因(ampr)，則仍然是完整的。將轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)物移至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，經(jīng)過這樣的選擇作用

4、而得以存活下來的所有細胞，都應(yīng)該帶上了pbr322質(zhì)粒分子。 在這些pbr322質(zhì)粒分子中，有一部分是在其tetr基因序列內(nèi)具有dna插入片段的重組質(zhì)粒。把這種富集了的培養(yǎng)物作適當?shù)南♂尯?，轉(zhuǎn)接到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長，于是在其pbr322質(zhì)粒分子的tetr基因序列中帶有dna插入片段的所有細胞，都將停止生長（注意：四環(huán)素不會使細胞死亡，只是抑制細胞的生長）。最后加入環(huán)絲氨酸，就會促使所有正在生長著的細胞發(fā)生溶胞反應(yīng)，那些沒有發(fā)生溶胞反應(yīng)而存活下來的細胞，大約有90100%都帶有pbr322重組質(zhì)粒，且在其tetr基因上都含有一個插入的外源dna片段，這些細胞可通過離心作用收集起來。 此外，

5、在pbr322質(zhì)粒的ampr基因序列中，也有一個pst i限制酶的唯一識別位點。ampr基因正常情況下表達產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，在其作用下青霉素會變成青霉酮酸，當加入碘-青霉素指示液（30% i2，1.5% ki，5%青霉素g，0.05m的ph 6.4的磷酸緩沖液），amprtetr菌落為無色透明。但當pbr322質(zhì)粒的ampr基因插入失活后，amprtets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的藍灰色。根據(jù)菌落周圍指示液顏色的改變與否，很容易鑒別出重組體菌落。 這種方法的優(yōu)點是無需把每一個轉(zhuǎn)化子接種在amp和tet平板上，直接在轉(zhuǎn)化平板上即可鑒定。其缺點是由于把指示液直接加入選擇平板內(nèi)，極易超成

6、菌落之間的相互污染，給其后的鑒定帶來困難。目前使用紙片法使這一方法得到了改善：預(yù)先將一定大小的紙片浸泡在指示液中，干燥后密閉保存，使用時只要將紙片覆蓋在轉(zhuǎn)化平板上，數(shù)分鐘內(nèi)就可以觀察到結(jié)果。 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 將puc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞，培養(yǎng)在補加有x-gal和乳糖誘導(dǎo)物iptg的培養(yǎng)基中時，由于基因內(nèi)互補作用形成的有功能的半乳糖苷酶，會把培養(yǎng)基中無色的x-gal切割成半乳糖和深藍色的底物，使菌落呈現(xiàn)出藍色反應(yīng)。 當puc質(zhì)粒載體的lacz 序列插入了外源dna片段時，會阻斷讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯

7、色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源dna插入序列的重組體克隆。 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征選擇重組體利用插入序列提供的表型特征選擇重組體分子分子 這種選擇法要求所克隆的dna片段是一個完整的序列，而且能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)功能的表達。其依據(jù)的基本原理是：轉(zhuǎn)化進來的外源dna編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如小鼠的二氫葉酸還原酶（dhfr）的分離： 先將含有dhfr-mrna的小鼠總mrna制劑反轉(zhuǎn)錄成cdna拷貝，構(gòu)建cdna基因文庫。根據(jù)小鼠dnfr對于藥物三甲氧芐二氨嘧啶呈現(xiàn)抗性這種性狀特征，將

8、轉(zhuǎn)化的細菌生長在含有三甲氧芐二氨嘧啶的培養(yǎng)基中（其含量水平為可以抑制大腸桿菌的dhfr的活性），選擇轉(zhuǎn)化子。這樣分離出來的抗性克隆，顯然都是由于具有小鼠dhfr基因的克隆片段，賦予寄主細胞新的抗性表型所致。 6.1.3 利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子 把dna包裝成有活性的噬菌體顆粒，主要取決于兩個因素：一是要具有能被噬菌體包裝蛋白和頭部前體所識別的區(qū)域，即cos區(qū)；二是dna的長度，只有重組體dna是野生型 dna的75105%的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而單一的載體dna是不會包裝成活的噬菌體顆粒的。 經(jīng)體外包裝，轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑，尤其是對

9、替換型載體，本身就是一種可利用的選擇標記。 另外ci基因插入失活后，會誘發(fā)溶源性細菌的原噬菌體進入溶菌周期，根據(jù)產(chǎn)生噬菌斑的清晰與混濁，也可以進行選擇。 6.2 利用核酸雜交篩選利用核酸雜交篩選 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù)。它所依據(jù)的原理是放射性同位素（32p或125i）標記的dna或rna探針進行dna-dna或dna-rna雜交，利用同源dna堿基配對的原則檢測特定的重組克隆。 核酸雜交篩選法的最大優(yōu)點是它可以普遍廣泛地應(yīng)用，尤其適合于大量群體的篩選，只要有現(xiàn)成可用的特異性探針，就可以有效地檢測任何一種插入的外源dna序列，而不以這種

10、序列能否在大腸桿菌中實現(xiàn)基因表達為前提。 6.2.1 原位雜交篩選原位雜交篩選 生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原來的位置不變地影印在硝酸纖維素濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、dna變性和雜交作用，而將母板很好地保存起來。因為變性dna同硝酸纖維素濾膜有很強的親和力，便在膜上形成dna的印跡，在80下烘烤濾膜，使dna牢固地固定下來。 用放射性同位素標記的rna或dna為探針同濾膜上的菌落所釋放的變性dna雜交，并用放射自顯影技術(shù)進行檢測，凡是含有與探針互補序列的菌落dna，就會在x光膠片上出現(xiàn)曝光點。根據(jù)曝光點的位置，便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽性菌落或噬菌斑，這就是所需要的

11、含有目的基因插入片段的重組體克隆。 6.2.2 核酸雜交檢測的探針核酸雜交檢測的探針 進行核酸分子雜交的前提是要有特定的dna或rna作探針。具有一定已知序列的核酸片段，大小通常為20kb左右，再帶上一定的探測標記，就構(gòu)成了核酸探針。它可以通過分子雜交與待測基因的dna序列結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，從而把待測基因的質(zhì)和量顯示出來。 1. 放射性探針 廣泛使用的探針，多是以32pdntp為標記前體，通過缺口轉(zhuǎn)移的方法，把天然dna或rna片段標記上放射性同位素。 此外還可以化學合成dna探針，只要已知目的基因產(chǎn)物的部分氨基酸序列，就可以從這個信息中，反推出基因編碼區(qū)可能的核苷酸排列順序。選擇一小段含有

12、獨特密碼子（met和try）或簡并性最小的密碼子（cys、his、phe和tyr等）的氨基酸序列，用化學法合成出相當于這些密碼子序列的寡核苷酸片段（1020個堿基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，將32pdntp轉(zhuǎn)移到合成的dna的5-oh末端（稱為末端標記 ），即成為標記好的探針。一個密碼子： met （甲硫氨酸） aug try （色氨酸） ugg二個密碼子： cys （半胱氨酸） his （組氨酸） phe （苯丙氨酸） try （酪氨酸） lys （賴氨酸） 2. 非放射性探針 由于32p放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且對人體有一定的損害，因而近年來又研制了非放射性物質(zhì)標記

13、核酸的方法，如糖基化探針、生物素探針、毛地黃苷標記等。 用生物素標記dna形成探針是目前用得較多的一種，它可以采用酶促或光促生物素來標記核酸。酶促法是利用缺口轉(zhuǎn)移的方法，但標記前體不是32pdttp，而是用嘧啶環(huán)c5位連接了生物素的dttp（或dutp），它可以有效地摻入dna中形成生物素探針。 光促法使用的試劑為光敏生物素乙酸鹽，它是由光敏基團、連接臂和生物素組成的。光敏基團可在光照下活化，與核酸的堿基結(jié)合，連接臂可以降低生物素基團對核酸雜交的空間位阻；生物素用做標記物。將待標記的核酸（dna或rna）與光敏生物素乙酸鹽混合，在近紫外的光源（如高壓汞燈、碘鎢燈）下照射1520分鐘，就可將生物

14、素標記在單鏈或雙鏈的dna或rna上，形成穩(wěn)定的共價結(jié)合。 標記好的生物素探針，可用于核酸的雜交反應(yīng)，然后用親和素-酶系統(tǒng)來顯示。親和素可以特異地與生物素結(jié)合，酶可與底物反應(yīng)進行顯色或化學發(fā)光，這就相當于放射性同位素探針雜交后的放射自顯影。最常用的工具酶是辣根過氧化物酶（hrp）和堿性磷酸酶（ap）。 非放射性方法進行核酸雜交，其靈敏度不如放射性方法高，但非放射性探針具有安全、穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點，是一種正在發(fā)展很有前途的方法。 6.3 利用免疫學方法篩選利用免疫學方法篩選 免疫學方法專一性很強、靈敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主細胞中的表達產(chǎn)物（多肽）作抗原，以該基因產(chǎn)物的免疫血清作

15、抗體，通過抗原抗體反應(yīng)將目的基因克隆檢出。 免疫學方法可以分為兩種：即放射性抗體測定法和免疫沉淀測定法。這些方法最突出的優(yōu)點是，它們直接檢測重組克隆所表達的蛋白產(chǎn)物，能夠檢測無任何可供選擇的表型特征的重組克隆。當然這種方法必須具備有效的特異性抗體。6.3.1 放射性抗體測定法放射性抗體測定法 這一方法所依據(jù)的原理為： (1) 一種免疫血清含有好幾種特異性抗體（igg），它們識別抗原分子上的不同定子，并分別同各自識別的抗原定子相結(jié)合； (2) 抗體分子或抗體的f(ab)部分，能夠十分牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯等塑料制品）上，而不會被洗脫掉； (3) 通過體外碘化作用，igg抗體便會迅速地被放

16、射性同位素125i標記上。 放射性抗體測定的主要程序是：(1) 首先把轉(zhuǎn)化的菌落涂布在平板上，長出菌落以后，再影印到另一塊平板上繼續(xù)培養(yǎng)，并保留原來的平板作為母板；(2) 待影印平板上的菌落長好后，置于含有氯仿飽和氣體的容器中使菌落裂解，陽性菌落便釋放出抗原；(3) 將吸附了未標記igg抗體的聚乙烯薄膜覆蓋在平板表面，如果抗原與抗體具有對應(yīng)關(guān)系，則在薄膜上形成抗原-抗體復(fù)合物；(4) 取下聚乙烯薄膜，再用125i 標記的igg處理，125i-igg便會與結(jié)合在聚乙烯薄膜上的抗原決定簇結(jié)合；(5) 漂洗聚乙烯膜除去過剩的125i-igg，干燥后進行放射性自顯影判斷結(jié)果，并從母板上獲得相應(yīng)的重組克隆。 對于能夠分泌表達產(chǎn)物的重組體克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更為簡化。例如分泌胰島素重組體克隆的篩選： 在放射免疫分析法基礎(chǔ)上，最近又發(fā)展