SNP分子標記的原理及應用解析PPT課件

1、SNP 的概念 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個核苷酸堿基的改變而導致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。 它包括單堿基的轉換, 顛換、 插入及缺失等形式。第1頁/共41頁SNP 的特點 （1）密度高SNP在人類基因組的平均密度估計為 11000 bp , 在整個基因組的分布達 3106個。（2）富有代表性某些位于基因內部的SNP 有可能直接影響蛋白質結構或表達水平, 因此, 它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。（3）遺傳穩(wěn)定性 與

2、微衛(wèi)星等重復序列多態(tài)性標記相比, SNP 具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實現(xiàn)分析的自動化SNP標記在人群中只有兩種等位型(allele) 。這樣在檢測時只需一個“ + - ”或“全無”的方式,這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化。 第2頁/共41頁 種族遺傳學 Tang 等研究了來自世界五個地區(qū)(中國、馬來、高加索、印度和非洲) 人群的MDR1 基因的單倍體和連鎖不平衡特征,發(fā)現(xiàn)具有e12/ 1236T2e21/ 2677T2e26/ 3435T 亞型的單倍型mh5 在非洲人群以外的四種人群中高度表達,而具有e12/ 1236C2e21/ 2677G2e26/ 3435C 亞型的單倍型m

3、h7 在非洲人群中占了1/ 3 以上,進一步證明了種族間的表形差異。第3頁/共41頁 疾病易感性研究 原理：SNPs 被認為是一種穩(wěn)定遺傳的早期突變,與疾病有著穩(wěn)定的相關性。當一個遺傳標記的頻率在患者明顯超過非患者時,即表明該標記與疾病關聯(lián),通過比較分析兩者的單倍型和研究連鎖不平衡性,可將基因組中任何未知的致病基因定位。 Horikawa 等應用SNPs作為遺傳標記通過基于連鎖不平衡的相關分析,在墨西哥裔美國人群和北歐人群中發(fā)現(xiàn)了一個DM 易感基因,該基因第三個內含子上的A/ G多態(tài)性(SNP43) 同2 型糖尿病(2 型DM) 連鎖,該位點為純合子G的個體患2 型DM 的風險增加,這是目前為

4、止所發(fā)現(xiàn)的第一個與2 型DM 相關的SNP ,預示了SNP 在DM 相關基因研究中的重要作用。第4頁/共41頁 藥物基因組學研究 SNPs 可以精細地反映個體的遺傳差異,SNPs 位點與個體的藥物反應進行相關分析,從而確定基因在藥物作用中的功能和意義。這樣既可以根據患者的遺傳特性設計治療方案,實現(xiàn)“個性化治療”,提高藥效，降低藥物的毒副作用,又可以在臨床試驗階段為特定的藥物選擇合適的受試者,提高效率,減少費用。第5頁/共41頁 遺傳育種的應用 檢測水稻SNP，研究優(yōu)良性狀與SNPs的關聯(lián)關系，指導育種。第6頁/共41頁SNP的的檢測方法基于以下9 種基本原理:l以結構為基礎; 1.1 限制性片

5、段長度多態(tài)性法 （RFLP ）; 1.2 單鏈構象多態(tài)性法 （SSCP ）; 1.3 變性梯度凝膠電泳 （DGGE ）;l 等位基因特異PCR（AS-PCR）; l RT-PCR; l 等位基因特異性雜交; l 引物延伸法-單堿基延伸法; l DNA直接測序法;l 飛行質譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測;l 變性高效液相色譜 ( DH PLC )法；第7頁/共41頁1.1 RFLP法原理：利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數量則會出現(xiàn)差異，根據電泳的結果就可以判斷是否SNP位點。第8頁/共41頁1

6、.2 單鏈構象多態(tài)性(SSCP)原理：單鏈DNA 在中性條件下會形成二級結構，不同的二級結構在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結構依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構象，最終會導致在凝膠上遷移速度的改變。 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈 DNA 和RNA 分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測SNP。特點：由于該方法簡單快速，因而被廣泛運用于未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。第9頁/共41頁1.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 原理：是利用長度相同的雙鏈 DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性

7、膠將 DNA片段分開的電泳技術。第10頁/共41頁2. 等位基因特異 PCR ( AS-PCR)原理：根據 SNP位點設計特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3末端與 SNP位點的堿基互補(或相同) ,另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進行設計,因此,AS-PCR技術是一種基于SNP的PCR標記。因為特異引物在一種基因型中有擴增產物,在另一種基因型中沒有擴增產物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產物的有無,從而確定基因型的 SNP。第11頁/共41頁3. RT-PCR 實時熒光PCR 技術( RT-PCR )一種通過檢測PCR 過程中和PCR 之后產生的熒光信號來區(qū)分等位基因類型的SNP 檢測技術,

8、同時基于熒光能量轉移原理( FRET) 。每檢測一個SNP 位點需要一條探針, 其3 端連有淬滅劑基團, 5 端連有熒光劑基團, 最終與SNP 位點完全匹配時探針結構被破壞, 從而發(fā)出熒光而被檢測。第12頁/共41頁第13頁/共41頁v定量分析n高靈敏TaqMan Gene Expression Master Mix 定性分析 高特異性TaqMan Genotyping Master MixABNew Master Mix第14頁/共41頁4. 等位基因特異性雜交 等位基因特異性雜(Allele specific hybridization ,ASH) 根據核苷酸探針和互補的目的片段進行雜交，

9、完全匹配和有錯配兩種情況下雜交復合體穩(wěn)定性的不同而將SNP 位點檢測出來。 等位基因特異核苷酸片段分析( ASO) ，基因芯片和動態(tài)等位基因特異性雜交( DASH) 等。第15頁/共41頁第16頁/共41頁5.引物延伸法-單堿基延伸法第17頁/共41頁單重SNaPshot數據第18頁/共41頁多重SNaPshot反應原理第19頁/共41頁SNaPshot操作流程第20頁/共41頁SNaPshotMultiplex試劑盒 SNaPshotMultiplex Ready Reaction Mix 一管做10個位點 對照: 30個反應 6條對照引物: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52

10、C/T, 60C 對照模板DNA: Ampliconfrom CEPH DNA 0.01 0.4 pmol純化的PCR模板 Matrix Standard DS-02dR110, dR6G, dTAMRA, dROX, LIZ第21頁/共41頁質粒SNaPshot PCR純化電泳樣本制備電泳PCR產物純化軟件分析第22頁/共41頁SNaPshot PCR第23頁/共41頁SNaPshot PCR產物純化Seal plate & incubate乙醇沉淀法: 11 個步驟, 1 小時Add reagentsCentrifugeEmpty plateAdd reagents Seal plate

11、& incubateAnalyzeRe-suspendDryCentrifugeEmpty plateSeal plate第24頁/共41頁加樣震蕩 30 分鐘分析離心封口BigDye XTerminator Purification Kit第25頁/共41頁6.DNA測序法 直接測序是最容易實施的SNP檢測方法。原理: 通過對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較, 以確定所研究的堿基是否變異, 其檢出率可達100%。 特點：可以得到SNP 的類型及其準確位置等SNP分型所需要的重要參數。第26頁/共41頁第27頁/共41頁7.飛行質譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測 原理：是將

12、變性的單鏈PCR產物通過與硅芯片上的化合物共價結合后, 在硅芯片上進行引物的退火,延伸反應, 突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據引物在延伸反應中所結合的不同堿基的不同質量在質譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。第28頁/共41頁 SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術是Sequenom公司推出的世界上領先的基因分析工具，通過引物延伸或切割反應與靈敏、可靠的MALDITOF質譜技術相結合，實現(xiàn)基因分型檢測。 基于MassARRAY 分子量陣列平臺的iPLEX GOLD技術可以設計最高多達40重PCR反應和基因型檢測，實驗設計非常靈活，分型結果準確性高。特別適合于對全基因

13、組研究發(fā)現(xiàn)的結果進行驗證，或者是有限數量的研究位點已經確定的情況。第29頁/共41頁MassARRAY技術原理: 先通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點上，延伸 1個堿基，在反應體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止。根據SNP位點的不同，探針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量。 將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶后在質譜儀的真空管經強激光激發(fā)，核酸分子解吸附為單電荷離子，電場中離子飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點信息。第30頁/共41

14、頁第31頁/共41頁第32頁/共41頁第33頁/共41頁第34頁/共41頁第35頁/共41頁第36頁/共41頁優(yōu)勢 （1）質譜儀檢測的是分子最本質的特征之一分子量，不涉及熒光標記、凝膠電泳等，就能檢測一個堿基的差異，準確性高，機器本身出錯的概率非常低； （2）質譜儀的靈敏度非常高，檢測窗口內，任何pmol級別的物質都能被檢測出來； （3）通量高：幾秒就能檢測完一個反應孔； （4）操作簡單，儀器要求簡單，除質譜儀外，都是常規(guī)PCR儀器； （5）靈活：每天可以完成幾個反應至上萬個反應； （6）便宜：引物不帶熒光標記，普通長度（3條引物總長80bp左右），此外在一個反應孔內能完成4個或更多的反應，即通常所說的4重反應； （7）兼容性強：質譜儀還能在核酸的其它方向，以及蛋白質組學、微生物鑒定等領域也能應用。 （8）質譜技術是“一管式操作”，即反應體系在生化學實驗過程中始終在一個試管內反應，沒有多次轉移，這樣就減少被污染的概率。第37頁/共41頁8.變性高效液相色譜( DHPLC)v原理：目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯配堿基的雜合異