細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分

1、細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分培養(yǎng)基種類經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，其中DMEM、 RPMI40、 MEM 、 DMEM/F12 都是應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。其他如 M199 、IMDM 、 L15 培養(yǎng)基等也用于某些細(xì)胞的培養(yǎng)。其具體的特征及應(yīng)用如下：1、BME 細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ) Eagle培養(yǎng)基（ Basal Medium Eagle）， _年 Eagle設(shè)計(jì)， BSS12 種氨基酸谷氨酰胺 8 種維生素。簡單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有 MEM、DMEM、IMDM 等。2、MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基又稱低限量 Eagle培養(yǎng)基（ Minimal Essential

2、Medium）， _年在 Eagles基礎(chǔ)培養(yǎng)基（ BME）上修改而來，刪去賴氨酸、生物素，氨基酸濃度增加，適合多種細(xì)胞單層生長，有可高壓滅菌品種，是一種最基本、試用范圍最廣的培養(yǎng)基，但因其營養(yǎng)成分所限，針對生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，并不一定是使用效果最佳或者最經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。3、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 是由 Dulbecco 改良的 Eagle培養(yǎng)基，起初是為小鼠成纖維細(xì)胞設(shè)計(jì)的。 DMEM 的氨基酸濃度是 MEM 的兩倍，維生素濃度是 MEM 的 4 倍，采用雙倍的 HCO3-和 CO2濃度起到更好的緩沖作用。最初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來為了某些細(xì)胞的生長需要，將

3、葡萄糖含量又調(diào)整為4500 mg/L，這就是大家常說的低糖和高糖了。低糖適于依賴性貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，特別適用于生長速度快、附著性較差的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。高糖更適合高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，也適用于附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點(diǎn)的克隆培養(yǎng)，也可用于雜交瘤中骨髓瘤細(xì)胞和 DNA 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。例如 CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、 CHO細(xì)胞表達(dá) EPO。4、IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基1 / 7Guilber 和 Iscove 將 Dulbecco Medium 改良為 Iscoves Medium，用于培養(yǎng)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞前體。此種培養(yǎng)液含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和 HEPES。并用硝酸鉀取

4、代了硝酸鐵。 IMDM 還能夠促進(jìn)小鼠 B 淋巴細(xì)胞， LPS 刺激的 B 細(xì)胞，骨髓造血細(xì)胞， T 細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的生長。 IMDM 為營養(yǎng)非常豐富的培養(yǎng)液，因此可以用于高密度細(xì)胞的快速增殖培養(yǎng)。5、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基Moore 等人于 _年在 Roswell Park Memorial Institute 研制，針對淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，含 BSS21 種氨基酸維生素 11 種等?，F(xiàn)也用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，如哺乳動(dòng)物、特殊造血細(xì)胞、正?；驉盒栽錾陌准?xì)胞，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，其它像 K2、HL0、Jurkat、Daudi、IM-9 等成淋巴細(xì)胞、 T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及 HCT-15上皮

5、細(xì)胞等均可參考使用。6、HamF10細(xì)胞培養(yǎng)基_年 Ham 設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。 F10 適用于倉鼠、人二倍體細(xì)胞，特適于羊水細(xì)胞培養(yǎng)。7、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基Hams F12是為在低血清濃度下克隆 CHO細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。 F12還可以與 DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應(yīng)用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細(xì)胞系的培養(yǎng)。由于營養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，故也常作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。8、M199 細(xì)胞培養(yǎng)基_年 Morgan 等設(shè)計(jì)的具有確定化學(xué)成分的細(xì)胞培養(yǎng)液

6、，即M2 / 79。除 BSS外，含有 53 種成分，為全面培養(yǎng)基，主要用于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。此培養(yǎng)液必須輔以血清才能支持長期培養(yǎng)。M-199 可用于培養(yǎng)多種種屬來源的細(xì)胞，并能培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?，F(xiàn)廣泛用于病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)。9、McCoy5A培養(yǎng)基_年 MeCoy 為肉瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)， BSS40 種成分。可支持多種（如骨髓、皮膚、肺和脾臟等）的原代移植物的生長，除適于一般的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，主要用于作組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細(xì)胞的生長支持。例如 Jensen大鼠肉瘤成纖維細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、 HT9、BHL-100等上皮細(xì)胞。0、L15 細(xì)胞培養(yǎng)基L-15 培養(yǎng)液適用于快速增殖瘤

7、細(xì)胞的培養(yǎng)，用于在CO2缺乏的情況下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株。此培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進(jìn)一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。培養(yǎng)基成分細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)：氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷

8、氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20冰箱中保存，在使用3 / 7前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4冰箱中儲存 2 周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。無機(jī)鹽培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素 , 細(xì)胞通常可耐受 260mOsm

9、/kg 320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加 HEPES時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細(xì)胞所需pH 在 7.2 - 74。但是，細(xì)胞培養(yǎng)最適 pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與 CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的 CO2 濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中 CO2 濃度設(shè)定在

10、 5，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L；如果 CO2 濃度維持在 10，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。 HEPES是一種非離子緩沖液，在 pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時(shí)對一些細(xì)胞可能有毒。 HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（ 0.34g/L）共用，以抵消因額外加入 HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為 pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。4 / 7

11、維生素在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長。其它成分在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 DMEM 培養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（ 2-Mercaptoethanol ，2-Me）。 2-Me 對細(xì)胞生長有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞增殖作用。 2-Me 的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過氧化物對培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA 合成，增加植物凝集

12、素 (PHA)對淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的 2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為 1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為 510-5M。常配制成 0.1M 的儲存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加 0.5ml。液體培養(yǎng)基保存：液體培養(yǎng)基應(yīng)于 4冰箱避光保存，實(shí)驗(yàn)前放入 37預(yù)熱。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為 12 個(gè)月。液體培養(yǎng)基中的 L-谷氨酰胺會隨著儲存時(shí)間的延長而慢慢分解。如果細(xì)胞生長不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。干粉培養(yǎng)基保存：4冰箱避光保存，有效期36 個(gè)月。血清

13、細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)5 / 7量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長，而不同批次的血清支持細(xì)胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細(xì)胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長的物質(zhì)。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細(xì)胞生長能力

14、進(jìn)行檢測，然后再大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點(diǎn)：（ 1）需要長期保存的血清必須儲存于 -20 70 低溫冰箱中。 4 冰箱中保存時(shí)間切勿超過 1 個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會增加約 10，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。（ 2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清。（ 3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法： -20 至 -70 低溫冰箱中的血清放入 4冰箱中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20進(jìn)入 37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。（ 5）切勿將血清在 37放置太久，否則血清會變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會破會而影響血清質(zhì)量。（ 6）血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下 “小黑點(diǎn) ”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象 “小黑點(diǎn) ”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，