蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟

1、.蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過一定的分離和純化,另外這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用需要利用待測蛋白的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行識(shí)別。關(guān)鍵詞：印跡蛋白質(zhì)步驟蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡westernblottingimmunoblotting免疫印跡法蛋白質(zhì)印跡法【實(shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過一定的分離和純化,另外這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用需要利用待測蛋白的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行識(shí)別。精品.如圖所示，可溶性抗

2、原，也就是待測蛋白首先要根據(jù)其性質(zhì)，如分子量，分子大小，電荷以及其等電點(diǎn)等采用不同的電泳方法進(jìn)行分離；通過電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗體（一抗）與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的原理，以抗體作為探針釣取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前應(yīng)首先加入非特異性蛋白，如牛血清白蛋白對(duì)膜進(jìn)行“封阻”而防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需再利用電泳方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上,我們把這個(gè)過程稱為電泳印跡。常用的兩種電轉(zhuǎn)移方法分別為:1.半干法: 凝膠和固相載體被夾在用緩沖溶液浸濕的濾紙之間,通電時(shí)間為10分鐘30分鐘。2.濕法：凝膠和固相載體夾心浸放在轉(zhuǎn)移緩沖溶液中，轉(zhuǎn)移時(shí)間可從

3、45分鐘延長到過夜進(jìn)行。由于濕法的使用彈性更大并且沒有明顯浪費(fèi)更多的時(shí)間和原料，因此我們在這里只描述濕法的基本操作過程。對(duì)于目的蛋白的識(shí)別需要采用能夠識(shí)別一抗的第二抗體。該抗體往往是購買的成品，已經(jīng)被結(jié)合或標(biāo)記了特定的試劑，如辣根過氧化物酶。這種標(biāo)記是利用辣根過氧化物酶所催化的一個(gè)比色反應(yīng)，該反應(yīng)的產(chǎn)物有特定的顏色且固定在固相載體上，容易鑒別。因此可通過對(duì)二抗的識(shí)別而識(shí)別一抗，進(jìn)而判斷出目標(biāo)蛋白所在的位置。其他的識(shí)別系統(tǒng)包括堿性磷酸酶系統(tǒng)和125i標(biāo)記系統(tǒng)。1. 實(shí)驗(yàn)器材精品.sds/page實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料；電轉(zhuǎn)移裝置；供電設(shè)備；pvdf膜（millipore immobion-p #ipvh

4、000 10）；whatman 3mm 紙；其他工具：鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤。易生物儀器庫：易生物試劑庫： 2. 實(shí)驗(yàn)試劑 10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（1l）：30.3g trizma base(0.25m), 144 g甘氨酸(1.92m),加蒸餾水至1l, 此時(shí)ph約為8.3，不必調(diào)整。 1x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（2l）：在1.4l蒸餾水中加入400 ml甲醇及200 ml10x 轉(zhuǎn)移緩沖溶液。 tbs 緩沖溶液:將1.22g tris (10 mm)和8.78g nacl(150 mm)加入到1l蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)ph至7.5。 ttbs buffer：在1l tbs 緩沖

5、溶液中加入0.5ml tween 20（0.05%）。 一抗：兔抗待測蛋白抗體（多克隆抗體）。(6) 二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔。 3% 封阻緩沖溶液（0.5l）：牛血清白蛋白15mg加入tbs緩沖溶液并定容至0.5l，過濾，在4c 保存以防止細(xì)菌污染。 0.5%封阻緩沖溶液（0.5l）：牛血清白蛋白2.5mg加入ttbs緩沖溶液并定容至0.5l，過濾，在4c 保存以防止細(xì)菌污染。 顯影試劑：1ml 氯萘溶液 (30mg/ml甲醇配置)，加入10 ml甲醇，加入tbs緩沖溶液至50 ml，加入30 ul 30% h2o2。精品. 染色液：1g氨基黑18b (0.1%)，250ml異丙醇(2

6、5%)及100ml乙酸(10%)用蒸餾水定容至1l。 脫色液：將350ml異丙醇(35%)和20 ml乙酸(2%)用蒸餾水定容至1l?！緦?shí)驗(yàn)操作】.蛋白質(zhì)的分離根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進(jìn)行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用sds/page技術(shù)。分離實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個(gè)小口以便定位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。.電轉(zhuǎn)移 準(zhǔn)備pvdf膜根據(jù)膠的大小剪出一片pvdf膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。 制作膠膜夾心 精品.在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個(gè)預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的

7、黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3mm紙，小心地將膠板放在3mm紙上，并注意排除氣泡。將pvdf膜放在膠的上方同時(shí)注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過的3mm紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時(shí)防止出現(xiàn)氣泡。 電轉(zhuǎn)移連接電源,在4c條件下維持恒壓100v，1小時(shí)。.免疫檢測 膜染色斷開電源，將轉(zhuǎn)移盒從轉(zhuǎn)移槽中移出，將轉(zhuǎn)移盒的各個(gè)部分分開。用鑷子將pvdf膜小心放入一個(gè)干凈的容器中，用tbs緩沖溶液進(jìn)行短暫清

8、洗，從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個(gè)干凈的容器中。將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘,確定蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。 膜的封閉和清洗對(duì)于沒有進(jìn)行染色的膜，首先倒出tbs緩沖溶液,加入3%封閉緩沖溶液,輕輕搖動(dòng)至少1小時(shí)。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用tbs緩沖溶液清洗3次, 每次5分鐘。 一抗倒掉tbs緩沖溶液，加入10 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗，輕輕搖動(dòng)1小時(shí)以上。從容器中倒出一抗及封閉緩沖溶液，用ttbs緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。 二抗精品.倒出ttbs 緩沖溶液，加入5 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動(dòng)30分鐘，倒出二抗及封閉緩沖溶液，用ttbs緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。 檢測倒掉ttbs 緩沖