色譜分析總復習

1、一、名詞解釋1capacity fact：容量因子，也稱分配容量或容量比，用k表示。其定義為：一定溫度與壓力下兩相達平衡后，溶質在固定相和流動相中分配量（質量或摩爾數(shù)）之比. 2分配系數(shù)：K,一定溫度與壓力下兩相達平衡后，組分在固定相和流動相中濃度的比值;3extra-column effect：柱外效應，即除柱內多種因素產生的色譜峰擴張外，其它產生峰擴張的因素之和：進樣系統(tǒng)，系統(tǒng)連接管，檢測器及其它柱外因素引起的峰擴張。4gradient elution：梯度洗脫，在HPLC分析中，控制流動相組成或洗脫強度隨時間的改變而改變，以使極性差異較大的多個組分均能分離,同時譜峰間隔較均勻，分析時間盡

2、量短。5HPSEC：高效體積排阻色譜法,即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離的液相色譜方法。常用于肽和蛋白質的分子量分布測定及多步分離純化程序中。其填料一般有硅膠基質和合成高聚物基質以及高交聯(lián)多糖型凝膠三種。6ODS：十八烷基鍵合硅膠，又稱C18. 典型的反相色譜柱，表面鍵和的基團為非極性羥基，適于分離弱極性，中等極性，較強極性及可電離的酸堿性有機物。7基線：在正常操作條件下，僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時所產生的連續(xù)的響應信號，一般是一條直線; 8峰面積：色譜曲線與基線間所包圍的面積; 9半峰寬：亦稱半寬度,半峰寬度,指色譜峰高一半處的寬度10標準偏差：正態(tài)分布曲線x=

3、1時（拐點）的峰寬之半。正常峰寬的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。 11死時間t0:流動相流過色譜柱所需時間(不保留組分流過色譜柱所需時間) 12調整保留時間:tR=tR-t0，指扣除死時間后的保留時間。13保留時間tR進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。 14相對保留值:(用或表示,也稱分離因子)兩個組分調整保留值之比=tR2/tR1=VR2/ VR2; 15分離度: 相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值，也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。16色譜柱效：每米柱長具有的理論塔

4、板數(shù)定義為色譜柱效，它是衡量色譜柱分離效能高低的一種量度。1.在進行HPLC分析時，為防止分析柱污染，應采取哪些措施？1）加一個保護柱（預柱），其固定相性質應與分離柱一樣或相近。2）樣品要盡量凈化，如沉淀蛋白，去除色素和無機鹽等。3). 樣品分析結束后,應及時用適當溶劑清洗色譜柱.2.乙醇的沸點為78.3，丁酮的沸點為79.6，在氣相色譜柱上是否一定是乙醇先出峰，丁酮后出峰，為什么？不一定.因為保留值除與樣品組分的沸點有關外，還與樣品及固定相的極性有關。乙醇（bp 78）和丁酮（bp 80）二個組分在非極性柱上，因為組分出峰的順序由蒸汽壓決定，沸點高的保留時間長，所以乙醇先出峰，丁酮后出峰；在

5、極性柱上，沸點和分子之間作用力同時作用，在強極性柱上分子間的作用力其主要作用，按極性大小出峰，乙醇的極性比丁酮大，所以丁酮先出峰，乙醇后出峰。4.電噴霧離子化的原理是什么?離子化過程分哪三步？原理：在噴針針頭與施加電壓的電極之間形成強電場，該電場使液滴帶電，帶電的溶液在電場的作用下向帶相反電荷的電極運動，并形成帶電的液滴。由于小液滴的分散比表面積增大，在電場中迅速蒸發(fā)，結果是帶點液滴表面單位面積的場強極高，從而產生液滴的“爆裂”。重復此過程，最終產生分子離子。ESI離子化可分為一下三個步驟：1）形成帶電液滴：在ESI高壓電極處施以正的高電壓，小液滴從毛細管高速噴出而帶有過量的正電荷，從而產生電

6、化學反應，通過溶劑組分氧化而去掉負離子或通過毛細管自身的氧化而增加正離子，當在ESI高電壓極處施以負的高壓，小液滴從毛細管高速噴出而帶有過量的負電荷；2）溶劑蒸發(fā)和小液滴破裂：隨著溶劑蒸發(fā)，液滴半徑縮小，液滴表面電荷斥力增大，達到一定半徑時，克服表面張力而裂解，重復此過程形成非常小的液滴；3）形成氣相離子：對于半徑=10nm液滴，電荷的斥力作用導致離子從液滴表面蒸發(fā)而不是液滴的分裂9、HPLC與GC比較，其特點？分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質只占有機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析較高沸點、較高分子量的、穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質占有機物總數(shù)的80%。流動

7、相的作用：GC采用的流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，與組分之間基本沒有作用；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的條件自由度較大。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過流動相組成來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC常常在室溫下進行。10、UVD紫外,FLD熒光,RID示差折光,ELSD蒸發(fā)光散射-這些檢測器哪些是通用型的檢測器？哪些是選擇性檢測器？哪些可與梯度洗脫兼容？哪些不兼容？UVD紫外: 由于不是所有化合物都有UV吸收，因此不是通用檢測器;與梯度洗脫兼容FLD熒光: 許多有機化合物，特

8、別是芳香族化合物、被一定強度和波長的紫外光照射激發(fā)后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。ELSD蒸發(fā)光散射：適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的且揮發(fā)性較小的樣品組分的檢測。 RID示差折光：是一種通用型檢測器,只要被測組分與流動相的折光率有差別就可使用。與梯度洗脫不兼容,價格較高。RID，ELSD是通用型檢測器。UVD,FLD,是選擇性檢測器。UVD, FLD, ELSD與梯度洗脫兼容。RID與梯度洗脫不兼容。11、氣相色譜分析中樣品的衍生化處理的目的及作用?待試樣品在適當條件下與所選試劑作用使其轉化成為滿足色譜分析要求的衍生物后再進行色譜分析。目的：（1）增加試樣的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，從而擴大氣

9、相色譜的應用范圍（2）改善分離效果，改進組分吸咐特性。（3）幫助未知物定性，增加檢測靈敏度和增加定量可靠性12、請簡述氣相色譜法分析油脂的脂肪酸組成樣品前處理過程?取約35滴植物油樣品于20ml試管中，加入0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2ml，60水浴中加熱至油珠完全溶解（約30min），冷卻后加入25%BF3甲醇溶液2ml，60水浴酯化20min，冷卻后加入2ml正已烷，振搖，加入2ml飽和NaCl溶液振搖，離心取上層有機相于一只干燥試管中并加入少量無水硫酸鈉以除去微量的水，供分析使用。13、什么樣的反相柱不會發(fā)生“疏水塌陷”？對于硅膠基質填料上的反相鍵合相-內嵌極性基團的反相鍵合相，極

10、性基團增加了表面水的濃度即改善與水的浸潤性；如果硅膠表面未濕潤，那么有效的色譜表面積會減少95%，被分析物的保留時間會顯著降低，即“疏水塌陷”。保留時間與填料表面積及配體（內嵌極性基團）有關。注意：幾乎所有的表面積都在孔內！14、流動相脫氣的目的？有哪幾種脫氣方式？流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準確：輸液量均勻準確，并且脈動減??；保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能： 防止氣泡引起的尖峰；基線穩(wěn)定，信噪比增加；溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱：減少死體積；防止填料的氧化在線脫氣裝置用于脫去溶解在流動相中的氣體，流動相先經過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速

11、不穩(wěn)定，造成基線漂移，噪音增加。除在線脫氣裝置外，目前也有采用離線超聲脫氣、真空脫氣、氦氣脫氣等方式。 五應用題1.離子抑制色譜技術在食品分析中應用較廣，請舉出一實例說明其技術的原理，并寫出色譜條件和樣品處理方法。紅葡萄酒中酚類化合物樣品預處理：將25L紅葡萄酒樣品通過聚酰胺柱（25917mmi.d.）,用5Polgamid-6(Serva)裝填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100L蒸餾水淋洗，再用150L30的甲醇（酸化至PH2.5）洗脫，洗脫液真空濃縮至5L左右，并用15甲醇定容至10L。色譜柱：ODS柱（125mm4mmI.D.,），室溫流動相：體積比為85:15的水甲醇（用HCl

12、O3調PH2.5）流 速：1.0ml/min 檢 測：UV-280nm 樣 品：紅葡萄酒原理: 多酚、有機酸。pH2-3,酸性條件下，電離受到抑制，保留值增大，就可以得到分離，不在酸性條件下，陰離子狀態(tài)不保留，流出色譜柱，就不能分離。2. 請簡述檢測果酒或黃酒中的中性酚和酸性酚的樣品處理方法和色譜條件(選用什么色譜柱和流動相及檢測器?檢測波長大致多少nm。 預處理: (1) 去除大分子,蛋白,用乙醇沉淀(2)中性酚或酸性酚:中性條件下用液液萃取(乙醚,乙酸乙酯萃取) 。酸性條件下,也可用乙醚,乙酸乙酯. 或固相萃取法.色譜條件：C18柱 流動相：乙腈:水:三氟乙酸 紫外檢測器 檢測波長270-

13、280nm 稱取一定量的酚類物質，溶于少量水，在棕色容量瓶中定容至10 mL，濃度分別為：兒茶素52.0 mg/L，綠原酸40.0 mg/L，咖啡酸44.0 mg/L，表兒茶素44.0 mg/L，香豆酸60.0 mg/L，阿魏酸44.0 mg/L，搖勻，放入冰箱4C避光儲存?zhèn)溆谩Ｅ渲茦藴嗜芤簳r，采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。 取25 mL原料用1 mol/L NaOH溶液調pH值至7.0，加入25 mL乙酸乙酯，用混合搖床震蕩10 min，然后轉移到分液漏斗中分離，水相再用25 mL乙酸乙酯萃取1次，合并酯相為中性酚。水相再用6 mol/L 的HCl溶液調pH值至2.0，再分別用

14、25 mL乙酸乙酯萃取2次，合并酯相為酸性酚。將中性酚和酸性酚合并后濃縮至干，殘渣溶于水中，并在棕色容量瓶中定容至25 mL，用0.22 m濾膜過濾，濾液于冰箱4儲存待測。 色譜柱：Eclipse XDB C8 (150 mm4.6 mm id，5 m)，流動相：A為甲醇；B為1乙酸水溶液 (V/V)；梯度洗脫程序：溶劑A在40 min 內由5上升到 30，然后變?yōu)?00，并維持 5 min，最后再返回到初始狀態(tài)。柱溫：30；流速：1.0 mL/min光電二極管陣列檢測器；檢測波長：280 nm；進樣量：20 L。3.請設計出測定某一多糖樣品的分子量分布或單糖組成的色譜分析方法（包括樣品處理方

15、法和色譜條件）。高效液相色譜法測定果汁的糖類組分含量1）、標準溶液系列配制分別準確稱取各種糖標準品100mg左右于10ml容量瓶中，用超純水溶解定容搖勻后，即得10mg/左右的標準溶液，再以此逐級稀釋成8mg/m, 6mg/m, 4mg/m, 2mg/m,1mg/m的標準溶液系列，均經0.45m微孔膜過濾，濾液供進樣用。2）、樣品處理準確量取3ml果汁至10ml容量瓶中用無水乙醇定容至刻度，離心后取上清液在熱水浴條件下用氮氣將乙醇吹去，再用水定容，并用0.45um有機相微孔膜過濾，濾液顏色若較深，再用Sep-Pak C18固相萃取小柱處理去除色素等雜質，處理后的樣液上機測定。3）、上機測定色譜

16、柱：Sugarpak1,6.5mmid300mm流動相：純水檢測器靈酸敏度：4柱溫：85流速：0.4ml/min進樣體積：10L4.分析多糖或多肽的分子量分布應采用何種色譜分離模式?請簡述該色譜模式的基本原理.高效凝膠過濾色譜（HPGFC）分析基本原理：按分子體積大小洗脫，凝膠色譜柱的選擇主要取決于被分離樣品的性質和糖組分分子量大小，以凝膠過濾色譜分析多糖的流動相一般為鹽溶液。用多個不同分子量的標準品作分子校正曲線(分子量對數(shù)對保留時間或保留體積作圖，一般為線性)，其分子量測定結果是一相對值，不是絕對分子量。 6、計算題 : 若在一個色譜圖上,測得tr=5.37cm,tm=0.52cm,w=1

17、.32cm,假定柱長為1m,計算:(1)理論塔板數(shù)和有效理論塔板數(shù).（2）塔板高度及有效塔板高度（3）分配比 （1）265，216（2）3.77mm,4.63mm（3）9.3注：N=5.54( )2=16( )2 根據(jù)色譜柱長L和理論塔板數(shù)N，可求出每個塔板高度 H=L/N Neff=16( )2 =5.54 ( )2 TR=TR-TM Heff= k=(tr-tm/)tm7、三聚氰胺的化學結構如下，請據(jù)此結構特點和本課程所學知識，選擇一種可用于三聚氰胺檢測的HPLC分離模式，并說明理由。答：從結構式可以看出三聚氰胺是非極性有機化合物，呈弱堿性，容易結合H+形成帶正電的陽離子，在以水-甲醇或水

18、-乙腈為流動相的反相柱（C18）上保留時間比較短，由于雜質的影響還會出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象。若在流動相中加入庚烷磺酸鈉試劑，則可以與樣品中的陽離子形成離子對，使其成為電中性分子，利于延長樣品的保留時間，分離效果會得到提高。因而可選擇分離模式為反相離子對色譜對其進行分離。8、對于單糖和低聚糖的HPLC測定，有多種柱系統(tǒng)（包括色譜柱和流動相）可供選擇，請簡述其中兩種柱系統(tǒng)的組成，并說明其分離機制（即分離模式）分離柱流動相分離模式氨基鍵合相C18耐堿性柱環(huán)糊精鍵合相石墨化碳柱乙腈水或乙腈甲醇水稀NaOH溶液（Ph11）乙腈-水（0.1%甲酸）215%乙醇，含1mmol/lNaOH正相分配反相色譜正相色譜

19、吸附，反相分配陽離子交換柱（Ca2+、Ag+、Pb2+、K+型或或H+型）水或稀酸（pH2）空間排阻，配位交換15、HPLC主要分為哪幾種類型？答：正相色譜、反相色譜、凝膠色譜、離子凝膠色譜、手性色譜、親和色譜按分離機理可以將HPLC分為五類：分配色譜基于被分離組分在兩相中的分配系數(shù)不同(根據(jù)固定相和流動相相對極性的差別,又可分為正相色譜和反相色譜)；吸附色譜基于被分離組分對活性的固定相表面吸附力的不同；離子交換色譜利用不同離子與固定相上的相反電荷離子間作用力大小的不同進行分離；體積排阻色譜利用固定相孔徑的不同，把被分離的組分按分子大小分開的一種色譜分離方法；親和色譜依據(jù)生物分子與固定相上鍵合

20、的配位體之間存在的特異性親和作用能力的差別，而實現(xiàn)對具有生物活性的物質進行分離16、簡述正相色譜和反向色譜的特點（包括：固定相和流動相的相對極性，不同極性化合物的出峰順序，流動相極性大小與洗脫強度的關系）。答：正相色譜：固定相極性較強，流動相極性較弱；樣品極性越強出峰越晚；流動相極性越強，洗脫強度越大反向色譜：固定相極性較弱，流動相極性較強；樣品極性越強出峰越早；流動相極性越強，洗脫強度越小。17、對于HPLC,影響分離度的k、N三要素分別與哪些色譜條件有關?k 與流動相組成(主要是溶劑比例、pH等)、固定相的性質和用量及柱溫有關。由流動相組成(特別是有機溶劑種類和pH值等)、固定相的性質及柱

21、溫等因素決定。N（或H）由板高方程各項參數(shù)決定，一般隨色譜柱長、填料粒徑、填充均勻度、流速和溫度等操作條件的變化而變。18請簡述氣相色譜氣路系統(tǒng)中的“隔膜吹掃氣”和“尾吹氣”的作用。答：隔膜吹掃氣是通過進樣器隔墊下面將隔墊(即密封墊)因高溫產生的揮發(fā)物帶去機外所用的氣體,可以防止對分析結果的影響，可以減少峰的拖尾，但流量太大時，峰面積會變小。尾吹氣是從色譜柱出口直接進入檢測器的一路氣體，又叫補充氣或輔助氣。其作用是減少FID入口至檢測器的死體積，縮短氣體的停留時間，從而消除檢測器的死體積的柱外效應。3.何謂反相離子對色譜？影響其保留值的因素主要有哪些？離子對試劑的鏈長和有機溶劑的比例如何影響保

22、留值？答：反向離子對色譜是將與被分析離子帶相反電荷的離子(配對離子或反離子)加到流動相中，與溶質離子結合形成弱極性離子對，此離子對在流動相中不易離解而迅速轉移到鍵合相中，進而在固定相和流動相間進行分配，最終實現(xiàn)分離的一種反向色譜模式。如三聚氰胺的分離，三聚氰胺是弱堿性有機物，在溶液中主要以陽離子存在，在以水-甲醇或水-乙腈為流動相的反相柱（C18）上保留時間比較短，由于雜質的影響還會出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象。若在流動相中加入庚烷磺酸鈉試劑，則可以與樣品中的陽離子形成離子對，使其成為電中性分子，這樣樣品的保留時間會增大，分離效果會得到提高。影響因素：1)介質：反相過程常用的介質上以水為主體的緩沖溶液，

23、其中pH值影響最大，PH則更加陰離子的保留增加，陽離子則相反。另外，緩沖液中離子類型和濃度也是重要選擇性參數(shù)。 2)對離子濃度：增加反離子的濃度可增加保留，但這種關系并非是線性的3)有機改性劑：以水為主體的流動相中通常增加極性有機溶劑，如甲醇，乙腈等做改進劑，有機溶劑的加入改善了締和分子在兩相中的分配4)溫度：它影響容量因子和離子化平衡的PK值離子對試劑的鏈長越短，其穩(wěn)定性就越差。鏈長不同，形成離子對的能力不同。有機溶劑的加入會影響原有緩沖溶液的PH值，另外對肽的離子化程度和締和分子在兩相中的分配起改善作用。比例，影響離子對的強度。5. 理論塔板數(shù)和有效理論塔板數(shù)的計算公式？兩者的區(qū)別？ 兩者

24、的區(qū)別：由于在色譜柱中存在著死體積（在組分的保留時間中包括了死時間），因此，從分配平衡理論計算出來的理論塔板數(shù)n并不能完全反映柱效，利用扣除死體積（或扣除死時間）后的調整保留體積（時間）計算的有效理論塔板數(shù)neff能更真實地反映柱效。6、速率理論方程 ，其中H,A,B,及u各表示什么意思？H塔板高度;A渦流擴散項，指固定相填充不均勻引起的擴散;B-縱向分子擴散項，分子沿色譜柱軸向擴散引起的色譜譜帶展寬;C-傳質阻力項，指組分在流動相和固定相之間傳質的阻力，由于溶質分子與固定相、流動相分子間相互作用，阻礙溶質分子快速傳遞實現(xiàn)分布平衡，導致有限傳質速率的分子間作用力稱為傳質阻力，固定相傳質阻力+流

25、動相傳質阻力; u流動相流動的線速度.7、B = 2 r Dm，其中Dm表示什么？在GC還是HPLC中可以忽略B？為什么？Dm組分在流動相中的擴散系數(shù)。HPLC中可以忽略，縱向分子擴散顯著存在于GC中.由于組分在液相中的擴散系數(shù)只有氣體中的1/105，因此在液相色譜中B可以忽略。(該擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈“塞子”狀。隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴散，造成譜帶展寬)8、在UPLC超高效液相色譜（Ultra Performance LC）中，為什么高流速仍能得到很高的柱效？ 從van Deemter曲線可以看出，u對縱向擴

26、散項（B/u）和傳質阻力項(Cu)的影響不一致，H先隨u的增加而降低，達到最小值后隨著u的增加而增加。由于UPLC系統(tǒng)采用1.7m顆粒，即顆粒度非常小，理論塔板高達不會隨著線性流速的增加而明顯增加，柱長可以比用5m顆粒時縮短3倍而保持柱效不變，而且使分離在高3倍的流速下進行，結果使分離過程快了多倍而分離度保持不變。9、何為反相離子抑制色譜的分離模式？舉例說明。答：在反相色譜法中，通過調節(jié)流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術稱為離子抑制色譜法。以葡萄酒中酚類物質的測定為例，由于酚類物質均有弱酸性，極性較強，在水和甲醇中有較大溶解度

27、。因此，在甲醇/水為流動相并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。若采用離子抑制色譜法可較好的分離。樣品處理：將25mL紅葡萄酒樣品通過聚酰胺柱（259mm17mmid,用5Polgamid-6(Serva)裝填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100L蒸餾水淋洗，再用150mL30的甲醇（酸化至PH2.5）洗脫，洗脫液真空濃縮至5L左右，并用15甲醇定容至10L。 色譜柱：ODS柱（125mm4mmiD）流動相：體積比為85:15的水甲醇（用HClO3調PH2.5）流速為1L/min；檢測波長為280nm。10.液相色譜分析雞精中的肌苷酸和鳥苷酸含量采用反相高效液相色譜，按分子

28、極性大小，使雞精中各種組分同時得到分離，利用紫外檢測器測定肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉組分含量。1).標準溶液系列配制分別準確稱取肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉標準品20mg左右于100ml容量瓶中，用超純水溶解定容搖勻后，即得0.2mg/左右的標準溶液，再以此逐級稀釋成0.1mg/m, 0.05mg/m, 0.01mg/m, 0.005mg/m,0.001mg/m的標準溶液系列，均經0.45m微孔膜過濾，濾液供進樣用。2).樣品處理準確稱取200mg左右雞精至10ml容量瓶中用3ml水溶解，然后用無水乙醇定容至刻度，充分搖勻，靜置，過濾后取3ml濾液用N2吹至0.5ml以下，再用水定容至3ml，搖勻后用0.45u

29、m有機相微孔膜過濾，濾液再用 C18固相萃取小柱處理去除色素等弱極性雜質，處理后的樣液上機測定。3).色譜條件色譜柱：Diamosil C18, 4.6mmid250mm，5um流動相：甲醇：0.05H3PO4溶液 5：95檢測：254nm，DAD柱溫：30流速：1.0ml/min進樣體積：5L4).上機測定4.1標準曲線制作將不同濃度的系列標準品分別上機進樣分析，以峰面積為橫坐標（x），濃度為縱坐標（y）作線性回歸，得到肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉的標準曲線方程、相關系數(shù)及線性范圍。4.2樣品測定將三個平行樣品溶液分別進樣，每個樣均重復進樣3次取其峰面積平均值代入標準曲線方程或單點校正計算含量。11.

30、請簡述分析果汁中葡萄糖、果糖及蔗糖的色譜條件與樣品處理方法，并說明樣品處理的主要步驟的目的答：色譜條件：色譜柱：Sugarpak1,6.5mmid300mm 流動相：純水 檢測器靈酸敏度：4 柱溫：85 流速：0.4ml/min 進樣體積：10L樣品處理方法：(1)準確量取3ml果汁至10ml容量瓶中用無水乙醇定容至刻度，目的是提取果汁中的葡萄糖、果糖及蔗糖，沉淀蛋白質和大分子糖。(2)離心，取上清液在熱水浴條件下用氮氣將乙醇吹去，用水定容至刻度。除去乙醇，以防HPLC分析時影響糖的分離。(3)用0.45um有機相微孔膜過濾，濾液顏色若較深，再用Sep-Pak C18固相萃取小柱處理去除色素等

31、雜質。目的是除去蛋白質和大分子糖沉淀，消除色度對分析的影響。(4)處理后的樣液上機測定12、HPLC測定茶多酚中兒茶素含量（實驗2）所使用的是什么色譜分離模式？流動相中為何要加酸？對于普通硅膠基質鍵合相C18柱，pH最低不能小于多少？離子抑制色譜法，選用Zorbax SBC18色譜柱，以甲醇水三氟醋酸（或醋酸）為流動相。在流動相中加入酸，目的是改變流動相的pH值，抑制溶質電離，使溶質在色譜過程中以中性分子保留。對于普通硅膠基質鍵合相C18柱，pH最低不能小于2。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數(shù)目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度

32、洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。 在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視： 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別

33、小心。 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。 混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。需讓1030倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。1

34、. 色譜法按分離原理分類, 可分為吸附色譜，分配色譜，排阻色譜和離子交換色譜。2. 所采用流動相的密度與液體接近, 粘度又與氣體接近的色譜方法稱超臨界流體色譜法。3. 1956年范德姆特提出色譜速率理論方程。其方程簡式表示為HABuCu 4. 分離非極性組分, 可選擇非極性固定液, 組分分子與固定液分子之間的作用力主要為色散力5. 目前常用的色譜柱有填充柱和空心毛細管柱兩種。6.根據(jù)范氏方程，試簡要分析要實現(xiàn)色譜快速分析應注意哪些操作條件？ 答:要兼顧到提高柱效和加快分析速度兩個方面。提高載氣流速可加快分析速度，抑制分子擴散 (B/u)，但將使傳質阻力增加 ( Cg+ Cs) 為此，可采用降低

35、固定液用量，減少液層厚度 df，同時應用輕質載氣提高 Dg來減少氣相傳質阻力等措施。因此，結論是：選用輕質載氣，減少固定液用量，提高載氣流速。7.試預測下列操作對色譜峰形的影響, 并簡要說明原因。 (1) 進樣時間超過 10 s (2) 氣化溫度太低，以致試樣不能瞬間氣化 (3) 加大載氣流速很多 (4) 柱長增加一倍 答: 1. 譜峰變寬,柱外分子擴散加劇。 2. 譜峰變寬，柱外分子擴散加劇。 3. 峰形變窄，保留時間縮短。 4. 峰形變寬,增加0.4倍，保留時間增加。8.試預測下列實驗條件對色譜峰寬的影響, 并簡要說明原因. (1) 柱溫增加(2) 相比減小(3) 分配比增加(4) 試樣量

36、減小很多 答: (1) 峰寬減小，因為分配系數(shù)減小。 (2) 峰寬增加，傳質阻力增加。 (3) 峰寬增加，傳質阻力增加。 (4) 峰寬減小，柱外初始帶寬減小。第一章1.由俄國植物學家茨維特創(chuàng)立的色譜法, 應該是屬于(4)液-固色譜 2.什么叫氣-固色譜法? 氣-固色譜法是流動相為氣體, 固定相為固體吸附劑。分離原理是利用組分與固體吸劑的吸附與脫附能力不同進行分離?？蛇m用于氣體及低沸點烴類3.什么叫氣-液色譜法? 氣-液色譜法是流動相為氣體, 固定相為液體。分離原理是利用組分與固定液的溶解揮發(fā)能力不同進行分離。可適用于在固定液中有一定溶解度的試樣。4.試比較氣相色譜法與高效液相色譜法的優(yōu)缺點。H

37、PLC法不受試樣揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制, 更適合于分析生物大分子、離子型化合物、熱不穩(wěn)定的天然產物和其它高分子化合物。另外HPLC的流動相不僅有使試樣沿柱向前移動的作用, 且可與被測組分分子發(fā)生相互作用, 使選擇條件增加一個。 但相對而言, GC法分析速度較快, 方法靈敏度較高、方便且耗資較低。第二章1.色譜圖上的色譜峰流出曲線可說明什么問題？ 解：可說明（1）根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)。（2）根據(jù)峰的保留值進行定性分析。（3）根據(jù)峰的面積或高度進行定量分析。（4）根據(jù)峰的保留值和區(qū)域寬度，判斷色譜柱的分離效能。（5）根據(jù)兩峰間的距離，可評價固定相及流動相選擇是否合適。2

38、. 反映色譜柱柱型特性的參數(shù)是：C.相比 3.什么叫死時間？用什么樣的樣品測定？ 解： 不被固定相吸附或溶解的組分，從進樣開始到柱后出現(xiàn)最大值所需要的時間。通常對于熱導池檢測器用空氣作為測試樣品，對于氫火焰離子化檢測器，常用甲烷（CH4）作為測試樣4.對某一組分來說，一定柱長下，色譜峰的寬或窄主要決定于組分在色譜柱中的B. 擴散速度5.指出下列哪些參數(shù)改變會引起相對保留值增加？為什么？C.降低柱溫6.色譜法按固定相的固定方式分類, 除柱色譜法以外, 還有紙色譜和薄層色譜。7.某一色譜柱從理論上計算得到的理論塔板數(shù)n 很大，塔板高度H很小，但實際上分離效果卻很差，試分析原因。 解：n是通過保留值

39、來計算的，沒有考慮到死時間的影響，實際上tm對峰的影響很大，特別是K3時，扣除死時間算出的neff，有效塔板高度Heff很大，因而實際分離效能很差。 第三章1.為什么要測定定量校正因子？ 解：由于組分的峰面積不等于其重量或百分含量，也就是說，在同一類型的檢測器上，重量或濃度相同的不同種物質產生的信號是不一樣的；在不同類型的檢測器上，同一種物質產生的信號也是不一樣的，因此，為了使產生的響應信號能定量代表物質的含量，就要測定校正因子。 2.測苯二甲酸混合物中間苯二甲酸含量，稱取樣品0.3578g,內標物癸二酸0.1029g，將樣品及內標物甲酯化后進行氣相色譜分析，測得間苯二甲酸二甲酯的峰面積為23

40、.7單位，癸二酸二甲酯的峰面積為24.5單位，已知這兩種酯的重量校正因子分別為0.77和1.00，求間苯二甲酸的含量 解：查出癸二酸分子量為202，癸二酸二甲酯為230，間苯二甲酸分子量為166，間苯二甲酸甲酯分子量為194。 先計算間苯二甲酸二甲酯的量（m1）：第四章1.在氣相色譜分析中為了測定下面組分，宜選用哪種檢測器？為什么？（1）蔬菜中含氯農藥殘留量；（2）測定有機溶劑中微量水；（3）痕量苯和二甲苯的異構體；（4）碑酒中微量硫化物 解（1）蔬菜中含氯農藥殘留量選用電子捕獲檢測器，因為根據(jù)檢測機理電子捕獲檢測器對含有電負性化合物有高的靈敏度。殘留農藥是含有電負性化合物，選用電子捕獲檢測器

41、檢測。（2）有機溶劑中的微量水選用熱導池檢測器檢測，因為熱導池檢測器是通用型檢測器，只要有導熱能力的組分均可測定，故可測定微量水。而氣相色譜其它幾種檢測器如氫焰、電子捕獲、火焰光度檢測器根據(jù)檢測機理均不能測定水。（3）痕量苯和二甲苯的異構體可用氫火焰離子化檢測器，因為氫火焰離子化檢測器對含C、H元素的有機化物有高的響應信號，特別適合。（4）啤酒中微量硫化物選用火焰光度檢測器，因為火焰光度檢測器是只對硫、磷有響應信號，且靈敏度特高，故為首選。 2.相對保留值和保留指數(shù)都是表示某組分的相對保留能力的大小，二者不同的是什么？解：相對保留值和保留指數(shù)二者不同的是，相對保留值以任意選定的單個化合物作為參

42、比標準，而保留指數(shù)則以正構烷烴系列作為參比標準，把物質的保留行為用兩個緊靠近它的兩個正構烷烴來標定。3.已知苯的沸點為80.1，環(huán)已烷的沸點為80.8，采用非極性固定液能分離開嗎？采用中等極性或更強極性的固定液能分離開嗎？為什么？解：苯和環(huán)已烷的沸點很相近，若采用非極性固定液（SE30，液體石臘）是很難將它們分離的。但苯比環(huán)已烷容易極化，如果用中等極性的鄰苯二甲酸二壬酯固定液（DNP），使苯產生誘導偶極，此時苯的保留時間是環(huán)已烷的1.5倍，能將苯與環(huán)已烷很好分離。苯后出峰，若選用強極性的b，b氧二丙腈固定液，則苯的保留時間是環(huán)已烷的6.3倍，很容易分離。4.對于永久性氣體的分離為什么常采用氣固

43、色譜？答：盡管氣液色譜應用面廣，但是H2、O2、N2、Ar2等永久性氣體在氣液色譜柱上，不能得到分離，由于它們在固定液上的溶解度都極小，使分配系數(shù)幾乎一樣，沒有差別，即固定液對永久性氣體無選擇性，而固體吸附劑對永久性氣體有好的吸附能力，使得永久性氣體組分在氣固色譜中有較大的分配系數(shù)，彼此可分離5.推薦兩種分離脂肪酸甲酯的固定相，丁二酸二乙二醇聚酯（DEGS）和丁二酸新戊二醇聚酯（NGPS），對于分離飽和與不飽和脂肪酸甲酯，哪一種固定液更好呢？ 固定液 x y z u s DEGS 496 746 590 837 835 NPGS 272 469 366 559 472答：對于飽和與不飽和脂肪酸

44、甲酯的分離，我們必須考慮有高的z值使其對酯基有好的保留外，還要從不飽和度的分離考慮柱子的選擇，要選擇x值高的固定液，因為x值是表示芳烴和烯烴物質在固定液上的滯留程度， x值越高，說明烯烴物質在該固定液上的滯留時間長，從上面兩組數(shù)據(jù)可看出，DEGS的x與z均比NPGS高得多，因而選用DEGS固定液，分離效果更好些。6.試對下列試樣設計氣相色譜分析操作條件：（1）丙酮中微量水的測定；（2）超純氮中微量氧的測定；（3）蔬菜中含有機磷農藥的測定；（4）微量苯、甲苯、二甲苯異構體的測定。答：（1）采用氣固色譜法，高分子多孔微球（GDX）為固定相，氫氣為流動相，熱導池檢測器。（2）采用氣固色譜法，5A分子

45、篩為固定相，氫氣為流動相，熱導池檢測器。（3）采用氣液色譜法，OV210為固定相，氮氣為流動相，火焰光度檢測器。（4）采用氣液色譜法，鄰苯二甲酸二壬酯有機皂土為固定相，氮氣為流動相，氫火焰離子化檢測器。 7.對色譜固定液有何要求？固定液有哪些分類法？答：1. 選擇性好，對各組分的分配系數(shù)有較大的差別。 2. 在使用條件下蒸氣壓低，否則固定液流失引起噪聲及柱壽命短、保留值重現(xiàn)性差。 3. 操作溫度下呈液態(tài)，粘度小，凝固點低。 4. 熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性好。在高溫下不分解，不與載體發(fā)生化學反應。 5. 對載體具有一定的浸潤能力，能形成均勻的液膜。 固定液的分類方法主要有，按固定液的相對極性、按固定

46、液的特征常數(shù)及按固定液的化學結構和所含官能團等分類方法。第五章1.采用相同固定液的毛細管柱和填充柱上分離同一樣品，欲達到相同的分離度，為什么毛細管柱比填充柱要求更高的理論塔板數(shù)？解：毛細管柱與填充柱的本質差別之一是毛細管柱的相比遠高于填充柱的相比，填充柱的相比值b一般是440，而毛細管柱在501500之間，所以，當ris、K一定時，在一定溫度下，分離相同的物質，達到相同的分離度，毛細管柱所需的理論塔板數(shù)比填充柱多。 第六章1.高效液相色譜是如何實現(xiàn)高效、快速、靈敏的？答：氣相色譜理論和技術上的成就為液相色譜的發(fā)展創(chuàng)造條件，從它的高效、高速和高靈敏度得到啟發(fā)，采用510mm微粒固定相以提高柱效，

47、采用高壓泵加快液體流動相的流速；設計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經典液相色譜的缺點，從而達到高效、快速、靈敏。2.什么叫離子色譜？解：在低交換容量的分離柱上，分離樣品離子，而在高效換容量的抑制柱上，通過化學反應，把具有高電導的流動相轉變?yōu)榈碗妼У牧鲃酉?，這樣就可以在電導檢測器上對被分離樣品離子進行高靈敏度的檢測。這種采用分離柱、抑制柱和電導相結合的離子交換色譜稱為離子色譜。3.為了測定鄰氨基苯酚中微量雜質苯胺，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動相：水甲醇、異丙醚已烷，應先用哪種固定相、流動相？為什么？解：鄰氨基苯酚中微量雜質苯胺測定，為了良好分離，應讓苯胺先出峰，由于苯胺的極性小于鄰氨基苯酚，因此采用正相色譜法，應選硅膠為固定相，異丙醚已烷為流動相。4.何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析？與程序升溫有什么不同？ 解：梯度淋洗就是在分離過程中，讓流動相的組成、極性、pH值等按一定程序連續(xù)變化。使樣品中各組分能在最佳的K下出峰。使保留