釀酒酵母的大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)

1、實(shí)驗(yàn) 釀酒酵母的大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)15升中型發(fā)酵罐的了解及使用，將整個(gè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程分成幾個(gè)階段，系統(tǒng)的表現(xiàn)了發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程，包括使用發(fā)酵設(shè)備前期整個(gè)設(shè)備給水、給無菌空氣、給高壓蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在實(shí)際操作過程中各個(gè)管路之間的切換，發(fā)酵用各個(gè)檢測(cè)設(shè)備的標(biāo)定。并以釀酒酵母的純化培養(yǎng)開始、再進(jìn)行搖瓶放大、最后實(shí)現(xiàn)發(fā)酵罐的發(fā)酵生產(chǎn)的具體實(shí)驗(yàn)過程，讓學(xué)生學(xué)會(huì)在發(fā)酵過程中能夠分階段的進(jìn)行采樣檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)值對(duì)發(fā)酵的條件進(jìn)行必要的調(diào)節(jié)，最后對(duì)于發(fā)酵所得到的產(chǎn)物進(jìn)行必要的分離純化，制成成品并保存，從而掌握整個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程的具體實(shí)施過程。實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介1

2、5升發(fā)酵罐圖示升發(fā)酵罐圖示發(fā)酵罐罐路示意圖發(fā)酵罐罐路示意圖空氣流量計(jì)電加熱器冷凝管空氣水蒸氣a03a02a01s03s01s02vt1v01p02w01c01w03w02罐體管路說明管路說明一、空氣及其凈化 來自空壓機(jī)的壓縮空氣經(jīng)凈化器（外接減壓穩(wěn)壓器、除水、除塵、空氣預(yù)過濾器）進(jìn)入發(fā)酵罐空氣總管，空氣流量計(jì)a01、閥a02、單向閥、空氣過濾器、閥a03到達(dá)反應(yīng)器內(nèi)，尾氣經(jīng)閥排出，本管路具有計(jì)量、凈化作用。注：空氣流量級(jí)顯示的流量是以過濾器前的壓力下的流量，不是標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的流量。二、蒸汽蒸汽進(jìn)夾套蒸汽經(jīng)閥s01進(jìn)入夾套（上進(jìn)），經(jīng)閥v01排出冷凝水。蒸汽對(duì)培養(yǎng)基預(yù)熱。蒸汽進(jìn)反應(yīng)器蒸汽經(jīng)閥s02

3、、單向閥、空氣過濾器、閥a03進(jìn)入罐內(nèi)，由排氣口控制閥vt1排出。蒸汽對(duì)過濾器及空氣管線消毒。蒸汽進(jìn)取樣閥及放料閥蒸汽經(jīng)閥s03進(jìn)入取樣閥，由閥p02排出冷凝水。蒸汽對(duì)取樣閥及底閥滅菌。三、自來水自來水進(jìn)夾套當(dāng)電磁閥c01打開時(shí)，自來水經(jīng)自動(dòng)注水閥、閥w01進(jìn)入反應(yīng)器夾套（下進(jìn)），由夾套上口、閥w02、加熱器、電磁閥c01排出；當(dāng)電磁閥關(guān)閉時(shí)，夾套水經(jīng)w02進(jìn)入電加熱器、循環(huán)泵、單想閥進(jìn)入夾套（下口），通過夾套水的循環(huán)，將加熱器的熱能帶入夾套，通過夾套的換熱加熱發(fā)酵液。注：溫度自動(dòng)前必須對(duì)夾套注水自來水進(jìn)排氣冷凝器自來水經(jīng)閥w03進(jìn)入排氣冷凝器，對(duì)發(fā)酵尾氣進(jìn)行冷卻盡可能減少培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。實(shí)

4、驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟葡萄糖1g氯化鉀1.8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g蒸餾水1000ml一、發(fā)酵前的準(zhǔn)備工作一、發(fā)酵前的準(zhǔn)備工作1酵母菌活化：由種子活化到試管斜面上。2按照下列配方配制麥?zhǔn)希╩eclary）培養(yǎng)基300ml，113滅菌20min。 將300ml種子培養(yǎng)液分成兩份，無菌操作取釀酒酵母菌斜面菌苔，接種于種子培養(yǎng)液，搖床培 養(yǎng)2448小時(shí)。 3補(bǔ)料液的配制及滅菌：配制0.2mol/l naoh溶液、0.6mol/l hcl溶液、食用油分別裝入補(bǔ)料瓶中，將連在補(bǔ)料瓶上的橡皮管，用繩子扎緊，121滅菌20min。4培養(yǎng)基的制備：酵母膏25g、naac82g、kcl 18g、葡萄糖10g。加

5、水溶解攪拌均勻。 5溶氧電極標(biāo)定：零點(diǎn)標(biāo)定：將電極拔出浸沒于飽和的無水亞硫酸鈉溶液中，待電極顯示值穩(wěn)定后標(biāo)零點(diǎn)1。斜率標(biāo)定：溶氧電極的斜率（滿度）標(biāo)定一般在發(fā)酵之前，溫度、罐壓、通氣量均在正常情況下進(jìn)行，一般以100標(biāo)定，因?yàn)樗莻€(gè)相對(duì)值，也可以是其他數(shù)值，罐壓對(duì)溶氧量影響較大，標(biāo)定時(shí)應(yīng)保持罐壓相對(duì)穩(wěn)定。6ph電極標(biāo)定：ph電極零點(diǎn)和斜率不能在發(fā)酵狀態(tài)下標(biāo)定，只能在滅菌以前進(jìn)行，但可以在發(fā)酵過程中進(jìn)行零電位補(bǔ)償。標(biāo)定前電極需泡于液體中并已聯(lián)機(jī)1小時(shí)以上，通常采用兩點(diǎn)標(biāo)定法：先將電極洗凈擦干，然后浸入6.86緩沖液，并將零點(diǎn)標(biāo)定值設(shè)為6.86，然后按開始標(biāo)定鍵，待ph顯示值穩(wěn)定后可按零點(diǎn)標(biāo)定結(jié)束

6、鍵，然后洗凈擦干電極后同樣方法標(biāo)定斜率，然后再標(biāo)定零點(diǎn)，反復(fù)至更換緩沖液時(shí)，ph未經(jīng)標(biāo)定已達(dá)標(biāo)準(zhǔn)值（附近）即可。7蠕動(dòng)泵流量標(biāo)定 蠕動(dòng)泵的標(biāo)定隨時(shí)可以進(jìn)行?？梢詫?duì)酸、堿泵、補(bǔ)料泵、消泡劑泵進(jìn)行標(biāo)定，方法相同。先取定量的液體，安裝好，然后在標(biāo)定畫面上設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)容量。然后將手、自動(dòng)開關(guān)調(diào)節(jié)到手動(dòng)位置，使泵運(yùn)轉(zhuǎn)并將管內(nèi)空氣排出開始滴液，將出口液體滴入標(biāo)準(zhǔn)容器，同時(shí)按標(biāo)準(zhǔn)開始鍵并確定，此時(shí)開始以秒為單位計(jì)數(shù)，待輸出液體到達(dá)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)容量時(shí)，再按確定。整個(gè)標(biāo)定過程結(jié)束。此時(shí)，加料速度便由控制器顯示出來。標(biāo)定結(jié)束后將開關(guān)置于“關(guān)”的位置。8將4步驟配制好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中，加水至體積約11.5升（防止水蒸

7、發(fā)過多）。二、實(shí)罐滅菌操作二、實(shí)罐滅菌操作1、準(zhǔn)備l蓋緊罐蓋上的各種蓋帽，旋緊罐蓋上的壓緊螺栓，l關(guān)緊發(fā)酵罐底閥p01，倒入培養(yǎng)基，調(diào)整ph值，旋緊接種口。l關(guān)排氣冷凝器進(jìn)水w03，移去進(jìn)出口的軟管排盡冷凝水夾套中的水2、培養(yǎng)基預(yù)熱l準(zhǔn)備工作 預(yù)先啟動(dòng)蒸汽發(fā)生器及空氣壓縮機(jī)。 將控制器中的溫度控制設(shè)定為手動(dòng) 開排氣閥vt1，關(guān)閉其他所有閥們 開排氣閥vt1，開夾套冷凝水閥v01排夾套水，關(guān)閉其他閥門。l啟動(dòng)反應(yīng)器攪拌馬達(dá)。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速200-300rpm。l蒸汽進(jìn)夾套：緩慢開夾套蒸汽閥s01蒸汽進(jìn)夾套（注意：此時(shí)有輕微爆破聲屬正常，如聲音過響，則開閥速度應(yīng)減慢）。待排水總口排出蒸汽時(shí)調(diào)節(jié)冷凝水閥v

8、01，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夾套內(nèi)壓力不要超過0.2mpa。當(dāng)培養(yǎng)基預(yù)熱至98時(shí)，進(jìn)入實(shí)罐滅菌操作。在培養(yǎng)基溫度在80-90時(shí)可以適當(dāng)?shù)臏p慢升溫速度，在本溫度區(qū)域可以殺滅大部分微生物。l蒸汽進(jìn)取樣閥：開出料閥p02（關(guān)緊底閥p01），開蒸汽閥s03，蒸汽進(jìn)入取樣閥內(nèi)腔，當(dāng)閥p02 排盡冷凝水后應(yīng)調(diào)節(jié)其開度，以少量蒸汽排出即可。3、實(shí)罐滅菌l蒸汽進(jìn)過濾器：停攪拌，微開過濾器上排冷凝水閥v02，開過濾器前蒸汽閥s02，微開過濾器后排冷凝水閥v03，緩緩開切斷閥a03，蒸汽經(jīng)過過濾器進(jìn)入反應(yīng)器，當(dāng)冷凝水閥v02、v03出口冷凝水很少時(shí)，調(diào)節(jié)冷凝水閥v02、v03以有少量蒸汽排出為

9、宜。當(dāng)排氣口有蒸汽排出或罐溫到達(dá)100兩分鐘后，關(guān)閉排氣閥vt1。調(diào)節(jié)切斷閥a03和蒸汽閥s02，維持過濾器前蒸汽壓力為0.12-0.16mpa，同時(shí)必須保證切斷閥有一定開度，不得關(guān)死。當(dāng)罐溫達(dá)到100時(shí)，培養(yǎng)基中的溶氧接近零，可以標(biāo)定溶氧的零點(diǎn)。l當(dāng)達(dá)到預(yù)定溫度或罐壓，開排氣閥vt1至有少量蒸汽排出，關(guān)緊或微開夾套蒸汽閥s01，微開底閥p01（開閥時(shí)觀察視鏡處培養(yǎng)基翻騰的變化，以有少量變化為宜），根據(jù)罐壓或罐溫變化的趨勢(shì)。及時(shí)調(diào)節(jié)蒸汽閥s02、s03。閥門調(diào)節(jié)應(yīng)微調(diào)，避免大幅度開關(guān)。當(dāng)反應(yīng)器罐壓或罐溫維持在預(yù)定的范圍內(nèi)開始計(jì)時(shí)。l保溫開始后，排氣閥蒸汽排量不宜太小，否則可能導(dǎo)致液面以上的罐體

10、部分尤其罐蓋達(dá)不到消毒溫度。l保溫階段應(yīng)旋松接種口蓋至有少量蒸汽冒出。4、滅菌完成及降溫（先開后關(guān)，后開先關(guān)）l保溫結(jié)束后首先旋緊接種口蓋。旋緊罐底閥p01，再關(guān)緊取樣器的蒸汽閥s03。l關(guān)緊空氣管線切斷閥a03及冷凝水閥v03，關(guān)緊過濾器前蒸汽閥，全開空氣閥a01、a02，開冷凝水閥v03用空氣吹過濾器，當(dāng)罐壓接近0.05mpa時(shí)關(guān)閉閥v03，緩緩開空氣管線切斷閥a03，空氣進(jìn)入發(fā)酵罐。當(dāng)過濾器冷凝水閥v02排盡冷凝水后就可以關(guān)閉l關(guān)夾套蒸汽閥s01、冷凝水閥v01，開夾套進(jìn)水閥w01和循環(huán)管線切斷閥w02。在控制器中將溫度控制方式設(shè)定為“自動(dòng)”，發(fā)酵罐進(jìn)入自動(dòng)降溫階段。按下攪拌開關(guān)，設(shè)定攪

11、拌轉(zhuǎn)速并“自動(dòng)”控制。l在降溫過程中，始終監(jiān)視罐壓，嚴(yán)禁壓力掉零。當(dāng)溫度到達(dá)工藝要求時(shí)，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓、標(biāo)定溶氧電極斜率及校正ph電極的零點(diǎn)。三、接種三、接種l調(diào)節(jié)進(jìn)氣量至3001000l/h，開排氣閥至罐壓接近于0（不得大于0.2kg/cm3），放松接種口，在火焰保護(hù)下打開接種口，迅速將種子倒入，旋緊接種蓋，立即調(diào)高罐壓，在控制器的初始化菜單中設(shè)定發(fā)酵批號(hào)，并開始進(jìn)行發(fā)酵。四、補(bǔ)料四、補(bǔ)料l將滅菌消毒的補(bǔ)料瓶放好，手動(dòng)安裝好輸液管，使中間接頭嵌在蠕動(dòng)泵凹槽內(nèi)l用酒精棉球擦拭罐蓋補(bǔ)料口，打開蓋后將針頭迅速插入并穿透密封蓋。l打開蠕動(dòng)泵手動(dòng)開關(guān)，使料液管中充滿料液，置開關(guān)為自動(dòng)。五、發(fā)酵及取樣檢測(cè)五、發(fā)酵及取樣檢測(cè)l取樣器消毒：半開閥p02，開蒸汽閥s03，蒸汽進(jìn)入取樣器，消毒時(shí)間5-10分鐘。l關(guān)蒸汽閥s03，全開出料閥p02，準(zhǔn)備取樣。l逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)取樣閥p01手柄，進(jìn)行取樣。回轉(zhuǎn)手