胚胎試驗(yàn)在水生動(dòng)物中的應(yīng)用

1、胚胎試驗(yàn)在水生動(dòng)物中的應(yīng)用建立靈敏、簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法 急性暴露試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便易行，但是其檢測(cè)指標(biāo)過(guò)于簡(jiǎn)單。 各種慢性毒性試驗(yàn)雖然提供多個(gè)檢測(cè)終點(diǎn)，但存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高等不足。 而水生生物胚胎試驗(yàn)具有成本低、影響因素少、靈敏度高等方面的優(yōu)勢(shì)，受試物種也由最初的魚(yú)類(lèi)向多樣化發(fā)展，其應(yīng)用日益廣泛。 魚(yú)類(lèi)成體和胚胎試驗(yàn)靈敏度比較胚胎試驗(yàn) 胚胎試驗(yàn)是又稱(chēng)胚胎毒性試驗(yàn)或胚胎致畸試驗(yàn)，指通過(guò)把胚胎暴露于受試化學(xué)物質(zhì)而受到毒害作用，繼而影響胚胎的發(fā)育、導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。 廣義上的胚胎試驗(yàn)包括所有以胚胎為材料的生物學(xué)試驗(yàn)，其內(nèi)容涵蓋形態(tài)學(xué)、發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)等方面 。 魚(yú)類(lèi) 魚(yú)類(lèi)因具有繁殖力高

2、、體外產(chǎn)卵、體外受精等生殖特性成為胚胎試驗(yàn)的最主要材料。拉丁名 通用名 文獻(xiàn) oncorhynchus mykiss rainbow trout 1,2 danio rerio zebrafish 1 brachydanio rerio zebrafish 2 cyprinus caprio common carp 1,2 oryzias latipes medaka 1,2 pimephales promelas fathead minnow 1,2 carassius auratus goldfish 1 menidia peninsulae tidewater silverside 1,

3、2 lepomis macrochirus bluegill 1 clupea harengus herring 1 gadus morhua cod 1 cyprinodon variegates sheepshead minnow 1,2 oncorhynchus kisutch coho salmon 2 oncorhynchus tschawytscha chinook salmon 2 salmo trutta brown trout 2 salmo salar atlantic salmon 2 salvelinus fontinalis brook trout 2 salveli

4、nus namaycush lake trout 2 esox lucius northern pike 2 catostomus commersoni white sucker 2 lepomis macrochirus bluegill 2 ictalurus punctatus channel catfish 2 jordanella floridae flagfish 2 gasterosteus aculeatus three-spined stickleback 2 menidia menidia atlantic silverside 2 用于胚胎試驗(yàn)的一些種類(lèi)斑馬魚(yú) 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

5、對(duì)單一物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)往往使用特定的種類(lèi)，斑馬魚(yú)是其中一個(gè)重要代表。歐洲和美國(guó)都有已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。zebrafish (danio rerio)甲殼類(lèi) 草蝦 草蝦屬?gòu)V鹽性甲殼動(dòng)物 (3-31ppt)。 分布廣(遍布美國(guó)東海岸和墨西哥灣的廣大河口)。 個(gè)體小，只要水溫，光照條件適宜，成體在實(shí)驗(yàn)室容易繁殖，只需分離不同發(fā)育階段的胚胎即可用于試驗(yàn)。 盡管雌體產(chǎn)卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎離體后同樣可以正常發(fā)育至孵化， 卵外被膜、胚胎透明而易于觀察形態(tài)異常。grass shrimp (palaemonetes pugio)grass shrimp (palaemonetes pugio)其它動(dòng)物 t

6、he frog embryo teratogenesis assay-xenopus (fetax) 爪蟾 astm e 1563-98: standard guide for conducting static acute toscicity tests with echinoid embryos 海膽 medaka (oryzias latipes) blue crab (callinectes sapidus)試驗(yàn)動(dòng)物的選取 被廣泛利用 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)容易大量培養(yǎng) 具有代表性和對(duì)受試物的敏感性 遺傳背景清楚 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)也有相應(yīng)的規(guī)范胚胎來(lái)源 多數(shù)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵后離體孵化，易于收集 。 一般可采

7、用親魚(yú)人工催產(chǎn)結(jié)合人工受精的方法獲得 。 對(duì)于如斑馬魚(yú)，青鳉等小型種類(lèi)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖相對(duì)容易，只需控制適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件，一般都能在試驗(yàn)當(dāng)天取到足夠數(shù)量的受精卵 。野外試驗(yàn) 收集魚(yú)卵 在實(shí)驗(yàn)室完成剩余的發(fā)育過(guò)程，檢測(cè)多個(gè)終點(diǎn)指標(biāo) 。 原位暴露 在室內(nèi)得到受精卵，用適當(dāng)?shù)难b置放置于待檢測(cè)的地點(diǎn)，全部發(fā)育過(guò)程或絕大部分發(fā)育過(guò)程在野外完成。 有抱卵習(xí)性的甲殼動(dòng)物，胚胎在母體腹部附肢發(fā)育成幼體，通過(guò)捕撈帶卵的母體，分離胚胎。分類(lèi) 胚胎試驗(yàn)同樣可分成急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn) 。 急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較短，其目的是獲得有關(guān)受試物的初步毒性信息；亞急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，可以貫穿胚胎發(fā)育的整個(gè)時(shí)期。 暴露途徑

8、可分為靜態(tài)，半靜態(tài)和流動(dòng)等 ，或微注射的途徑。 容器 透明的試驗(yàn)容器通常是首選，燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管是最普通的工具。 在野外暴露試驗(yàn)中，有黏性的受精卵可以被直接負(fù)在載玻片上，后者固定在特制的容器里 。溶劑 有機(jī)物質(zhì)水溶性較差，則需要化學(xué)溶劑來(lái)助溶，但不適當(dāng)?shù)娜軇?huì)影響結(jié)果的可靠性，化學(xué)溶劑本身對(duì)胚胎具有毒性甚至?xí)褪茉囄锂a(chǎn)生協(xié)同作用，因此，選用適當(dāng)?shù)娜軇┮约斑m當(dāng)?shù)臐舛葘?duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性都是有益的。 乙醇，丙酮，二甲亞砜是常用的溶劑，終濃度一般在0.1%以下 。0.5%(v/v)乙醇1%(v/v)乙醇對(duì)照grass shrimp (palaemonetes pugio)檢測(cè)終點(diǎn) 半致死濃度（lc50

9、） 形態(tài)異常 孵化延遲 生化指標(biāo) 遺傳物質(zhì) 生長(zhǎng)指標(biāo)半致死濃度（lc50） 半致死濃度（lc50） 死亡是檢測(cè)的可見(jiàn)終點(diǎn)，初步反映受試物的毒性，是急性毒性試驗(yàn)的常用指標(biāo) 。 孵化也可作為終點(diǎn)來(lái)反映受試物毒性，指標(biāo)采用半效應(yīng)濃度（ec50）。 在發(fā)育早期可以胚胎完整性來(lái)判斷存活與否，當(dāng)器官出現(xiàn)后則用器官的運(yùn)動(dòng)作為標(biāo)準(zhǔn)。 形態(tài)異常 形態(tài)異常是胚胎致畸試驗(yàn)的核心內(nèi)容 。 斑馬魚(yú)和爪蟾胚胎發(fā)育過(guò)程中有多種可以觀察的反應(yīng)指標(biāo)，被列入標(biāo)準(zhǔn)方法的觀察終點(diǎn)。 對(duì)于甲殼動(dòng)物，常見(jiàn)的觀察結(jié)構(gòu)有眼、卵黃形狀、心臟、頭部、肝胰腺 。 發(fā)育異常往往會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致終止發(fā)育或發(fā)育延遲，進(jìn)而推遲孵化時(shí)間。 b = brain;

10、c = chorda; ch =chorion; e = ear; ed = edema; eud = ear underdeveloped; ey = eye; eyud= eye underdeveloped; nc = negative control; tnd = tail not detached;woey = without eyes; woh = without head; wos = without somitescatfish (clarias gariepinus) 對(duì)照 cd 和cu1%(v/v)乙醇對(duì)照grass shrimp (palaemonetes pugio)孵

11、化延遲grass shrimp (palaemonetes pugio)生化指標(biāo) 隨著胚胎發(fā)育的深入，器官逐漸建成，一些酶活性也顯示出來(lái)，在暴露條件下酶活性的改變也可作為檢測(cè)終點(diǎn)；受試物既可抑制酶活性，也可使一些酶出現(xiàn)應(yīng)激性增強(qiáng) 。grass shrimp (palaemonetes pugio)受試物及其代謝物還可能對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生影響 grass shrimp (palaemonetes pugio)生長(zhǎng)指標(biāo)catfish (clarias gariepinus)pacfic herring (clupea pallasi)應(yīng)用現(xiàn)狀 單一化學(xué)品毒性 環(huán)境檢測(cè)項(xiàng)目 檢測(cè)土壤、沉積物污染 。 石

12、油降解產(chǎn)物；溢油事件的生態(tài)恢復(fù)研究 。 混合性工業(yè)生產(chǎn)廢水，生活污水的毒性，特別是致畸效應(yīng)，被用于探討遺傳毒性。 名稱(chēng) 拉丁名 污染物 文獻(xiàn) inland silverside pacific herring sturgeon mummichog rainbowfish surf smelt fathead minnows medaka grunion carp flagfish pacific herring medaka fathead minnows rainbow trout catfish medidia beryllina clupea harengus oryzias latip

13、es clupea harengus oncorhynchus mykiss 石油及降解產(chǎn)物 殺蟲(chóng)劑及除草劑 有機(jī)物 重金屬 7 8,80 9 10 11 13 30 59，60，68 62 35 38 28 44 48 67 23 分類(lèi) 化合物 終點(diǎn) 參考文獻(xiàn) 抗真菌劑 石油 重金屬 殺蟲(chóng)劑 有機(jī)化合物 chlorothalonil copper chromium aluminum methoprene endosulfan chlorpyrifos malathion fipronil anthracene pyrene -terthienyl methylene blue 2-methyl-1,4-naphthoquinone 4-nitroquinoline-n-oxide ethanol dimethylsulfoxide acetone 1 19 19，64 51 51 57 64 17,18 17,18 17,18 17,18 55 55 發(fā)展前