大腸埃希菌檢查法

1、大腸埃希菌檢查法Escherichia Coli Test Method1. 目的建立大腸埃希菌檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。2. 范圍適用于大腸埃希菌檢查的操作。3. 責(zé)任者QC化驗(yàn)員。4. 程序:4. 1.簡(jiǎn)述4. 1. 1.大腸埃希菌(Escherichia coli)即大腸埃希菌，為腸埃希菌科埃希菌屬 的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫竣埃希氏菌等5個(gè)種。大 腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸 埃希菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。大 腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā) 性腹瀉。

2、為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。4. 1. 2.用 4-甲基傘形酮葡糖昔酸(4-Methylumbelliferyl- P -D- glucuronide, MUG)和靛基質(zhì)(Indole)試驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其 檢 驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG-蛋口腺培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混 合菌中分離單個(gè)菌，如MUG、Indole試驗(yàn)為陽性或陰性即可報(bào)告結(jié)果。4.1.3.原理：利用LI標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng) 作為指示系統(tǒng)來鑒定目標(biāo)菌。實(shí)驗(yàn)證明，96%的大腸埃希菌含B -葡糖昔酸酶(P -glucuronidase, GUD), 約10 %的沙

3、門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒 光反應(yīng)的敬感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定 大腸埃希菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測(cè)。單一的MUG鑒別 大腸埃希菌其漏檢率達(dá)6%,鑒于98%的大腸埃希菌其靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性，故將 MUG與靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，比單用MUG可提高大腸埃希菌的檢岀率。如MUG與 Indole試驗(yàn)的反應(yīng)不一致時(shí)，則需將供試液的增菌培養(yǎng)物用EMB瓊脂平板分離培 養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)鑒別。該法理論上可使大腸埃希菌的檢出率達(dá) 98%。如僅用IMViC生化試驗(yàn)來鑒別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，其結(jié)果是含 混的。4.

4、2.儀器、設(shè)備及用具4. 2. 1.無菌室4.2.2. 凈化工作臺(tái)4.2.3. 培養(yǎng)箱(361C)4.2.4. 高壓蒸汽滅菌器4.2.5. 顯微鏡(1500X)4. 2. 6.微波爐4. 2. 7.恒溫水浴(45 1 C)4. 2. 8.離心機(jī)(500 4000r/min)4.2.9. 0.45 M m 0.02 u m 薄膜及4. 2. 10.電冰箱4. 2. 11.勻漿儀4. 2. 12.366nm 紫外燈4. 2. 13.玻璃器皿、器具4. 3.試液、指示液4.3.1. 0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9. 0g,加水使溶解成1000ml, 121C 滅菌20分鐘。4.3.2. 靛基質(zhì)試

5、液取氯化二屮氨基苯屮醛5. 0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充 分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免聚熱導(dǎo) 致溶液色澤變深，或取對(duì)二中氨基苯中醛l.Og,加入95%乙醇95ml,充分振 搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。4. 3. 3.甲基紅指示液 取甲基紅0. lg,加95%乙醇300ml,使溶解后加水至 500ml,即得。4. 3. 4. V-P 試液a-蔡酚乙醇試液：取荼酚6. 0g,加無水乙醇溶解使成100mlo氫氧化 鉀試液：取氫氧化鉀40. 0g、加水使溶解成100mlo4. 3. 5.革蘭染色液4.3.5. 1.結(jié)晶紫染液 取結(jié)晶紫l.O

6、g、95%乙醇20ml、1%草酸鞍(NH4)2C2O4J溶液80ml。將結(jié)晶紫洛于乙醇后，與草酸較混合，靜置48h,置密 閉棕色瓶，可存放數(shù)月。4. 3. 5.2.革蘭碘液 碘l.Og、碘化鉀20g、蒸鐳水300mlo用少量水溶碘化 鉀，再加碘，待全溶后，加蒸鐳水至30ml,置棕色瓶備用。4. 3. 5. 3.脫色液95%乙醇4. 3. 5. 4. 沙黃(番紅)染液 沙黃(SafranineO)0. 25gx 95%乙醇10ml、蒸鐳水 適量，將沙黃加入乙醇中，完全溶解后再加水至100mlo4. 3.6.亞甲藍(lán)指示液 取亞甲藍(lán)0.5g,加水溶解使成100mlo4. 3. 7.瀆麝香草酚藍(lán)指示液

7、 取澳麝香草酚藍(lán)0.4g,加lmol/L氫氧化鈉洛液0. 64ml使溶解，再加水稀釋至100mlo變色范圍pH6. 07.6(黃一紅)4. 3.8.酸性品紅指示液 取酸性品紅0.5g,加水100ml溶解，再逐漸加 lmol/L氫氧化鈉溶液16ml,每加1滴需將溶液充分搖勻后再加第二滴，直至溶 液呈草黃色：于沸水中保持15分鐘，靜置2小時(shí)，濾過，即得。變色范圍 pH6. 07. 4 (黃 f 紅)o4. 3.9.I曙紅鈉指示液 取曙紅鈉2. 0g,加水溶解使成100mlo4. 3. 10.無菌聚山梨酯80-氯化鈉溶液 取聚山梨酯80 1ml加0. 9%氯化鈉溶液 使成100ml, 121C滅菌2

8、0分鐘。4. 3. 11.無菌磷酸鹽緩沖液(pH7. 2)取磷酸氫二鈉25. 8g與磷酸二氫鈉4. 4g, 加水稀釋至1000ml, 121C滅菌20分鐘。4. 3. 12.無菌對(duì)氨基苯中酸試液 取對(duì)氨基苯中酸0. lg,加入含10ml水的具塞 試管中，121C滅菌20分鐘。4. 3. 13.中性紅指示液 取中性紅l.Og,研細(xì)，加95%乙醇60ml使溶解，再加 水至100mlo變色范圍Ph6. 88.0 （紅黃）o4. 3. 14.無菌氯化鈉-蛋白腺緩沖液（pH7.0）取磷酸二氫鉀3.56g,磷酸氫二 鈉7.23g ,氯化鈉4.30g ,蛋白腺l.Og ,加水1000ml ,加熱使溶解，過

9、濾。分裝，滅菌。4.4.培養(yǎng)基4.4.1.營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基陳10g氯化鈉5.0g牛肉浸出粉3. 0g水1000ml取上述成份混合,微溫溶解，調(diào)解pH為弱堿性,煮沸,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7. 2 0. 2 ,分裝，滅菌。4.4.2.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基腺10g氯化鈉5. 0g牛肉浸出粉3. 0g水1000ml瓊脂14. 0g取上述成份混合，微溫溶解，調(diào)解pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使 滅菌后為7. 20. 2,分裝，滅菌。4.4.3.膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）丿東20. 0g磷酸二氫鉀1. 3g乳糖50g牛膽鹽2. 0g氯化鈉5. 0g （或去氧膽酸鈉）（05g）磷酸氫二鉀40g水1000ml除乳糖

10、、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成 分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.40.2,煮沸，濾清，加入乳 糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。4. 4. 4. 4-屮基傘形酮葡萄糖化酶昔酸(4-methylumbelliferyl- P -D-glu- curonide, MUG)培養(yǎng)基腺10. 0g磷酸二氫鉀（無水）0. 9g硫酸鐳0. 5mg 硫酸鋅o. 5mg硫酸鎂0. lg 氯化鈉5.0g氯化鈣50mg6. 2g磷酸氫二鈉（無水） 亞硫酸鈉40mg 去氧膽酸鈉l.OgMUG 75mg水 1000ml除MUG夕卜，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 0. 1 ,加入

11、MUG,溶解，每管分裝5ml,滅菌。4.4. 5.曙紅亞屮基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB） 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml 20%乳糖溶液5ml亞屮藍(lán)指示液13-16血1取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60C,按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。4.4. 6.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC） 腺20. 0g 1%中性紅指示液3ml乳糖10. Og瓊脂14. Og牛膽鹽5. Og水1000ml氯化鈉5. Og除乳糖1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解, 調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.20.2,加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分, 搖勻，分裝，滅菌，冷至約60

12、C,傾注平皿。4.4.7.蛋白陳水培養(yǎng)基胰蛋白腺10g氯化鈉5g水1000ml取上述成分混合，加熱洛化，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.30. 1,分裝于小試 管，滅菌。4.4. 8.磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基腺7g磷酸氫二鉀（K2HP04 ）2g葡萄糖5g水1000ml取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.30. 1,分裝于小試 管，滅菌。4. 4. 9.枸椽酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉5g枸椽酸鈉（無水）2g硫酸鎂(MgS047H20)0. 2g澳麝香草酚藍(lán)指示液20ml磷酸氫二鉀（K2HP04）lg瓊脂14g硫酸二氫鞍l(fā)g水1000ml除指示液和瓊脂外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為6.9

13、 0.1,加入瓊脂，加熱洛化，加入指示液，混勻。分裝于小試管，滅菌，制成 斜面。注：所用瓊脂應(yīng)不含游離糖，用前用水浸泡沖洗。4.4. 10.乳糖培養(yǎng)基腺20. 0g乳糖10. 0g0.04%澳甲酚紫指示液 25ml水1000ml除0. 04%浪甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅 菌后為7.20.2,加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml。滅菌。 5%乳糖培養(yǎng)基腺 0. 2g漠麝香草酚藍(lán)指示液6ml氯化鈉0.2g乳糖5g磷酸氫二鈉0.2g水100ml除乳糖和指示液外，混合各成分，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.4,加 入乳糖/指示液，混合，分裝于含小倒管的滅菌小試管

14、中，115C滅菌15mino4. 5.對(duì)照用菌液取大腸埃希菌CMCC （B） 44102的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置361C培養(yǎng)1824小時(shí)，取均勻培養(yǎng)物1 ml用0.9% 滅菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10lOOcfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試 驗(yàn)的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。4.6. 準(zhǔn)備4. 6. 1.檢驗(yàn)量4. 6. 1.1.每批供試品檢驗(yàn)量，一般為10g或10ml,特殊貴重或微量包裝的供 試品檢驗(yàn)量可以酌減。4. 6. 1. 2.供試品均須取自2個(gè)以上的包裝單位。4.6.2.供試液的制備4.6. 2. 1.液體供試品 取供試品1

15、0ml,加無菌氯化鈉-蛋口腺緩沖液（pH7.0） 至100ml ,混勻，作為供試液。4.6. 2.2.固體、半固體或黏稠液供試品取供試品10g,加無菌氯化鈉-蛋白腺 緩沖液（pH7. 0）至100ml,用勻漿儀（30005000i7min、24min）或其他有 效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中 適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。4. 6. 2. 3.非水溶性供試品方法1取供試品5g （或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過45C） 5g司盤 80、3g單碩脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃棒 攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45C的pH7.0無菌氯化鈉

16、-蛋白）凍緩沖液至100ml,邊加 邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1： 20的供試液。方法2取供試品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見無菌檢查 法中供試品的無菌檢查項(xiàng)下）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷 酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品洛解。然后加入45C的pH7.0無菌氯化 鈉-蛋白腺緩沖液100ml,振搖5-10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水 層作為1： 10的供試液。以上供試品如吸水膨脹，或粘度過高，可增加稀釋劑的量，制成1： 201： 100供試液。4. 6. 2. 4.含抑菌成分供試品供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌，不能檢出時(shí)，表明供試品有

17、抑 菌活性。該供試液按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。同時(shí) 做陽性和陰性對(duì)照。稀釋法 取規(guī)定量的供試液接種到較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至 不具抑菌作用的濃度。離心沉法 取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入 裝有直徑為47mm、孔徑不大于0.450. 02 u m微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，過濾， 用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml,將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增 菌培養(yǎng)基中。中和法 取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于100ml增菌液（含1%對(duì)氨基苯甲酸 約15ml）

18、中，含神、汞類的供試品，于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中；含洗必 泰供試品，于含適量聚山梨酯80等表面活性劑的100ml增菌液中（表面活性劑 的用 量應(yīng)預(yù)試，用量過大有抑菌作用）。沉降法 取規(guī)定量供試液，自然沉降5min,取上層液于100ml增菌液中，本 法適用于難溶于水的抗菌制劑。4. 7.檢查方法驗(yàn)證在建立供試品的大腸埃希菌檢查法或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響 檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的抑菌活性及檢查法的可幕性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn) 證 試驗(yàn)按供試液的制備和大腸埃希菌檢查法所規(guī)定的方法進(jìn)行。4.7.1. 驗(yàn)證方法4. 7. 1.1.試驗(yàn)組取規(guī)定量供試液及10-100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)

19、基中，依 大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖 洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接種 至IJ增菌培養(yǎng)基中。4. 7. 1. 2.陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證大腸埃希菌檢查法的專 屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌。陰 性對(duì)照菌不得檢出。4.7.2. 結(jié)果判斷陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌， 按此供試液制備法和大腸埃希菌檢查法進(jìn)行供試品的大腸埃希菌檢查：若試驗(yàn)組 未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等 方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品

20、的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的大腸埃希菌檢查同時(shí)進(jìn)行。4. 8.操作步驟4. 8. 1.檢驗(yàn)程序4. & 1. 1.陽性對(duì)照試驗(yàn) 各供試品進(jìn)行大腸埃希菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽性對(duì)照試 驗(yàn)。陽性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10-lOOcfm供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供 試品的大腸埃希菌檢查。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢查出大腸埃希菌。已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供 試品，在該供試品檢查時(shí)不必再做陽性對(duì)照。4.8. 1.2.陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋劑10ml加入100ml （或200ml）大腸埃希菌檢 查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。4. 8. 2.增菌培養(yǎng)4& 21 取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基2份，每份各100

21、mlo 1份加入10ml供試液 （相當(dāng)于供試品1. lml. 10cm2），另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性 對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)48小時(shí)）,陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。4. 8. 2. 2.取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)取未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。 在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍(lán)口色熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG 陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基 質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰 性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供

22、試品檢出大腸埃希菌：如MUG陰性、靛基 質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。4& 3分離培養(yǎng)如呈現(xiàn)MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性.靛基質(zhì)陽性時(shí)， 應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)12ml環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB 或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落 與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。表1大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲 藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或 無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕 潤(rùn)，常有金屬光澤麥康凱瓊 脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊 緣

23、整齊，表面光滑，濕潤(rùn)當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌 落與 表1所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、染 色鏡 檢和 I H V i C 試驗(yàn)，確認(rèn)大腸埃希菌。為了規(guī)范操作，以下是對(duì)藥典要求的補(bǔ)充。4&4 純培養(yǎng)如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列特征相符或 疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2 3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)1824h ,作以下檢查。如平板上無單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤）,應(yīng)沾 取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB瓊脂

24、平板，培 養(yǎng)1824h ,再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。4& 5革蘭染色、鏡檢4. & 5. 1.以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜 面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次（載玻 片燙手）固定。4.8. 5.2.滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗。4& 53 滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水。4.8. 5.4.滴加95%乙醇，脫色2030秒鐘，水洗。4& 55 滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢。4.8. 5. 6.染色結(jié)果 革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭氏陰性呈紅色。大腸埃希菌為 革蘭陰性短埃希菌，或球埃希菌狀，亦有埃希菌狀

25、。4. 8. 5. 7.注意事項(xiàng)（1）玻片必須潔凈，無劃痕。涂片的菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆 或連成片。不利菌細(xì)胞染色反應(yīng)判斷及形態(tài)觀察。（2）培養(yǎng)物的菌齡以1624小時(shí)為宜。培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，革蘭陽性菌易染成紅 色。（3）脫色是關(guān)鍵。脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽性；脫色時(shí)間過長(zhǎng)，菌細(xì)胞 易染成陰性。（4）可用已知革蘭染色為陽性、陰性的菌種做染色的質(zhì)量控制。4. 9.生化試驗(yàn)4.9.1. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)2448h, 觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為澳麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣 （小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小）。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性

26、，亦可接中5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩 發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽性?；蜻m當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。4.9.2. 靛基質(zhì)試驗(yàn)(I)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白丿凍水培養(yǎng)基，培養(yǎng) 2448小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為 陽性，呈試劑本色為陰性。98%的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性，一般24小時(shí) 即可出現(xiàn)陽性結(jié)果。常以無菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛 基質(zhì)陰性，余下的蛋口腺水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時(shí)，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。4.9. 3.屮基紅試驗(yàn)(H)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖丿凍水培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)482小時(shí)，于培養(yǎng)液中加入屮基紅指示液23數(shù)滴(約每ml培

27、養(yǎng) 液 加指示液1滴)，輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為 陰性。4.9.4. 乙酰屮基屮醇生成試驗(yàn)(V-P)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄 糖 腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)482小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入a-蔡酚乙醇試液 lml,混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0. 4ml,充分振搖，在4小時(shí)(通常在30分 鐘)內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。4.9. 5.枸緣酸鹽利用試驗(yàn)(C)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸緣酸鹽培養(yǎng)基斜面 上，培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性， 培養(yǎng)基顏色無改變，無菌苔生長(zhǎng)為陰性。4. 10.結(jié)果判定4. 10. 1.當(dāng)陰性對(duì)照試

28、驗(yàn)呈陰性，陽性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽性、靛基質(zhì)陽性，供 試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，報(bào)告 噸或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰 性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告lg或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。4. 10.2. MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為一+ 、革蘭陰性埃希菌，扌艮 告lg或lml供試品檢出大腸埃希菌：MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC試驗(yàn)為 + + 一、革蘭陰性埃希菌，報(bào)告lg或lml供試品檢出大腸埃希菌。4. 10. 3.供試品培養(yǎng)物檢查不符合4.10.2中的任一項(xiàng)，報(bào)告lg或lml供試品 未檢出大腸埃希菌。4. 10.4當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)但非大腸埃希菌，不能做 出檢驗(yàn)報(bào)告。4. 11注意事項(xiàng)4.11.1. MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀 菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、埃希菌和芽抱菌，其MUG為陽 性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽性菌的干 擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法 能檢 出亦判為不合格。4.11.2. 配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4,否則pH 值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；