SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

1、實(shí)驗(yàn)二SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場(chǎng)中的泳動(dòng)。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都含有可電離基團(tuán)，在非等電點(diǎn)條件下帶有電荷，在電場(chǎng)力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用樣品中各種分子帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場(chǎng)中的遷移速度不同，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、純化和鑒定的一種綜合技術(shù)。可用于樣品的制備、 純度鑒定、分子量測(cè)定等。影響帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的因素影響帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的因素 1生物大分子的性質(zhì)：生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳

2、產(chǎn)生明顯影響。 2緩沖液：緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質(zhì)，溶液pH值距離等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時(shí)速度就越快。當(dāng)緩沖液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；當(dāng)緩沖液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶正電荷，電泳時(shí)向負(fù)極移動(dòng)。 3電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度指每單位介質(zhì)長(zhǎng)度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大會(huì)引起通過介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，從而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增多，最終導(dǎo)致介質(zhì)溫度升高。降低電流強(qiáng)度，可以減少產(chǎn)熱，但會(huì)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，引起生物大分子擴(kuò)散增加，同樣影響分離效果。所

3、以電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)強(qiáng)度。 4電滲：電滲：液體在電場(chǎng)中對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。由于支持介質(zhì)表面存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團(tuán)電離后使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場(chǎng)作用下向電極方向移動(dòng)，形成介質(zhì)表面溶液的流動(dòng)。 當(dāng)電滲方向與電泳方向相同時(shí)則加快電泳速度；當(dāng)電滲方向與電泳方向相反時(shí)，則降低電泳速度。 5支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔大小對(duì)生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，反之則泳動(dòng)速度慢。電泳技術(shù)的分類電泳技術(shù)的分類 1. 根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：根據(jù)電

4、泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：自由電泳不使用支持介質(zhì)，電泳在溶液中進(jìn)行。區(qū)帶電泳需使用支持介質(zhì)，根據(jù)支持介質(zhì)不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤狀電泳、毛細(xì)管電脈等。 2.根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：高壓電泳使用的電壓在5001000V，這類電泳分離速度快，但熱效應(yīng)較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。常壓電泳使用的電壓在500 V以下，電位梯度為210 V /cm。這類電泳的分離速度較慢，但對(duì)電泳設(shè)備要求簡(jiǎn)單。 3根據(jù)

5、電泳系統(tǒng)根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為連續(xù)是否連續(xù)分為連續(xù)p電泳和不連續(xù)電泳和不連續(xù)p電泳：電泳：連續(xù)pH電泳是指電泳全過程中pH保持不變，不連續(xù)pH電泳是指電極緩沖液和電泳支持介質(zhì)中的pH不同，甚至電泳支持介質(zhì)不同區(qū)段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4根據(jù)工作目的和分離樣品的數(shù)量多少分為分析電泳和根據(jù)工作目的和分離樣品的數(shù)量多少分為分析電泳和制備電泳制備電泳。 5根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)種類不同分為免疫電泳、層析電根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)種類不同分為免疫電泳、層析電泳、等電聚焦電泳、轉(zhuǎn)移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場(chǎng)泳、等電聚焦電泳、轉(zhuǎn)移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場(chǎng)凝膠電泳和相互垂直交替電場(chǎng)凝膠電泳

6、等。凝膠電泳和相互垂直交替電場(chǎng)凝膠電泳等。 6根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為細(xì)胞電泳、核酸電泳、蛋根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為細(xì)胞電泳、核酸電泳、蛋白質(zhì)電泳等白質(zhì)電泳等 電泳示蹤劑電泳示蹤劑 電泳常用的示蹤劑有溴酚蘭和二甲苯青FF。示蹤劑一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以確保樣品均勻沉入加樣孔內(nèi)。醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)【基本原理】【基本原理】 本實(shí)驗(yàn)用醋酸纖維薄膜作電泳支持物分離血清蛋白質(zhì)。血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都小于7.5，在pH=8.6的巴比妥緩沖溶液中都帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)。由于血清中各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不一，所帶凈

7、電荷有差異，所以它們的泳動(dòng)速率也不同。將微量血清點(diǎn)于薄膜上，通電電泳后，將薄膜置染色液中使蛋白質(zhì)固定并染色，可將血清蛋白質(zhì)分成5條區(qū)帶，從正極端起分別為白蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白?！静僮鞑襟E】【操作步驟】一、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣一、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣 1將醋酸纖維薄膜切成2.5 cm8 cm的小片。在薄膜無光澤面距一端1.5 cm處用鉛筆輕輕劃一線，表示點(diǎn)樣位置。 2將醋酸纖維薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖溶液面上（緩沖溶液盛于培養(yǎng)皿中），使膜條自然下沉。 3將充分浸透（指膜上沒有白色斑痕）的膜條取出，將薄膜無光澤面向上，平放在干凈濾紙上，用干凈濾紙吸去薄膜上多余的緩沖溶液。 4將膜

8、條（無光澤面向上）放于一干凈濾紙上，用寬1 cm的有機(jī)玻片在盛有血清的小燒杯中蘸一下，使軟片下端粘上薄層血清，然后按在薄膜點(diǎn)樣線上，讓血清滲入膜內(nèi)，移開軟片。二、電泳二、電泳 將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)無光澤面（即點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于陰極（切勿弄錯(cuò)）。槽架上四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙橋需貼緊并拉直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時(shí)安放多張薄膜，則薄膜之間應(yīng)相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，待平衡5分鐘后通電，電壓為10 V/cm長(zhǎng)（指膜條與濾紙橋總長(zhǎng)度），電流為0.40.6 mA/cm寬，電泳時(shí)間約1小時(shí)左右。三、染色三、染色 通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中

9、，染5分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 丙烯酰胺凝膠電泳：丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小（1100 g）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠。可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析；還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙

10、烯酰胺（Acr）與交聯(lián)劑甲撐雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，經(jīng)過聚合交聯(lián)形成含有親水性酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈，相鄰的兩個(gè)鏈通過甲撐橋交聯(lián)起來的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種： （1）化學(xué)聚合：通常采用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合作用。 （2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無色基，后者再被氧化成自由基而引發(fā)聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變小，不太穩(wěn)定?；瘜W(xué)聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復(fù)性好。故一般

11、采用化學(xué)聚合。 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 濃縮效應(yīng)在濃縮膠中進(jìn)行；電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在分離膠中進(jìn)行。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。 SDS是一種陰離子型去污劑，在蛋白質(zhì)溶解液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還

12、引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。 蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小成正比地變化。 這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長(zhǎng)度，也就是蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的函數(shù)。 【操作步驟】【操作步驟】 一、安裝垂直板型電泳裝置一、安裝垂直板型電泳裝置 二、凝膠的制備二、凝膠的制備 分離膠的制備在一個(gè)干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。 SDS-不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)12分離膠濃度，分離膠濃度，10ml體積配制量體積配制量 ： 1. 30% 凝膠貯液凝膠貯液4

13、.0ml 2. 分離膠緩沖液分離膠緩沖液 1.25ml 3. 10% SDS 0.1ml 4. ddH2O 4.0ml 5. 10% 過硫酸胺過硫酸胺0.06ml 6. 2%TEMED 0.6 ml濃縮膠的制備在另一個(gè)干凈的小燒杯中。 4.5分離膠濃度，分離膠濃度，5 ml體積配制用量表：體積配制用量表：1. 30% 凝膠貯液凝膠貯液0.75mL 2. 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液0.83mL 3. 10% SDS 0.1ml 4. ddH2O 3.0 mL 10% 過硫酸胺過硫酸胺0.03mL 5. 2%TEMED0.3 mL牛血清樣品2 樣品1 蛋白marker樣品1樣品2牛血清兩塊膠一個(gè)電泳

14、系統(tǒng)，兩組共用：第一組加樣第二組加樣第二塊膠加樣順序與第一塊膠相同三加樣三加樣 將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個(gè)樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為1015L。如樣品較稀，可加2030L。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。四電泳四電泳 將上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電源，開始時(shí)將電流控制在1520 mA,待樣品進(jìn)入分離膠后，改為3050 mA。待藍(lán)色染料遷移至下端約11.5 cm時(shí)，停止電泳，約需12小時(shí)。五剝膠五剝膠 取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，在染料區(qū)帶的中心插入細(xì)銅絲作為標(biāo)志

15、。六染色和脫色六染色和脫色 染色染色 用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。 加入染色液，染色45分鐘。脫色脫色 染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。2030min換一次脫色液，23次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過夜，直至背景清晰。 七七M(jìn)r的計(jì)算的計(jì)算 通常以相對(duì)遷移率(mr)來表示遷移率。相對(duì)遷移率的計(jì)算方法如下：用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及銅絲與凝膠頂端的距離，按下式計(jì)算： 相對(duì)遷移率(mr) = 樣品遷移距離(cm)染料遷移距離(cm)。 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對(duì)分子質(zhì)量 八轉(zhuǎn)膜八轉(zhuǎn)膜膠放在膠放在3張緩沖液浸濕的濾紙上，蓋上經(jīng)甲醇激活張緩沖液浸濕的濾紙上，蓋上經(jīng)甲醇激活（15-30sec）的）的PVDF膜（切多余的膜及紙，與凝膜（切多余的膜及紙，與凝膠一樣大?。┡艢馀?，蓋同樣膠一樣大?。┡艢馀?，蓋同樣3張緩沖液浸濕的濾紙，張緩沖液浸濕的濾紙，排氣泡。排氣泡。順序：順序：負(fù)極負(fù)極 3層濾紙凝膠膜層濾紙凝膠膜 3層濾紙正極，如圖。