醫(yī)學標書范本1

1、國家自然科學基金申請書項目名稱：msc 對先天性巨結腸癥腸道神經(jīng)組織重建的實驗研究申 請 者：所在單位：郵政編碼：通訊地址：410016重慶市渝中區(qū)醫(yī)學院路號電傳話：真：64申請日期：2000 年 12 月國 家 自 然 科 學 基 金 委 員 會一九九七年制項目類別申報學科代碼 1科學部編號cc03030310填 報 說 明一、填寫申請書前，請先查閱國家自然科學基金有關項目申請辦法及規(guī)定。申請書各項內(nèi)容，要實事求是，逐條認真填寫。表達要明確、嚴謹，字跡要清晰易辨。外來語要同時用原文和中文表達。第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出全稱。二、申請書為十六開本，復印時用 b5 復印紙，于左側裝訂成冊。第三頁

2、起各欄空格不夠時，請自行加頁。一式六份（至少一份為原件），由所在單位審查簽署意見后，按申報學科投送國家自然科學基金委員會對口科學部。地區(qū)科學基金項目，申請書另報送?。ㄗ灾螀^(qū)）科委一份原件。三、封面右上角“科學部編號”由對口科學部填寫，項目類別和申報學科代碼 1 由申請者填寫。四、下列人員不得作為申請項目的負責人提出申請，但可作為項目組成員參加研究：在讀（含在職）研究生已離退休的科研人員申請單位的兼職科研人員五、申請者和項目組中具有高級專業(yè)技術職務的主要成員申請（含參加）的項目數(shù)，連同在研的國家自然科學基金項目數(shù)（不含重點項目、重大項目），不得超過兩項。六、同一項目組研究內(nèi)容相近的項目，只允許報

3、送一個學科。七、申請者可因同類項目競爭等原因，提出不宜評議本項目的專家名單（姓名與單位，3 人以內(nèi)），密封于信封中，釘在申請書原件封面，或另專函相關學科，供科學部選擇同行評議人時參考。科學部將對此信息保密。八、國家自然科學基金委員會通訊地址：北京市海淀區(qū)花園北路35 號東門郵政編碼：100083一、簡表1簡 表 填 寫 要 求一、簡表內(nèi)容將輸入計算機，必須逐項認真填寫，采用國家公布的標準簡化漢字。簡表中所有代碼以最新發(fā)布的國家自然科學基金申請項目分類目錄及代碼為準填寫。高技術探索課題主題號按高技術新概念新構思探索課題項目指南中主題號填寫，申請其重點項目時項目類別也填寫 b，并在申請書封面右上角

4、加注“高技術探索課題重點項目”。二、凡選擇性欄目，將相應提示符 a、b 等之一填入該欄的右下角。三、部分欄目填寫要求：項目名稱應確切反映研究內(nèi)容和范圍，最多不超過 25 個漢字 (包括標點符號）?；A研究指以認識自然現(xiàn)象、探索自然規(guī)律為目的，不直接考慮應用目標的研究活動。應用基礎研究指有廣泛應用前景，但以獲取新原理、新技術、新方法為主要目的的研究。申報學科申請項目所屬的最基礎學科。如涉及多學科可填寫兩個，先填為主學科。申請金額以萬元為單位，用阿拉伯數(shù)字表示，注意小數(shù)點。起止年月起始時間從申請的次年 1 月算起。終止時間為完成年度的 12 月。所用實驗室系指研究項目將利用的實驗室，僅填寫國家計委

5、批準的國家重點實驗室或部門批準的開放實驗室。所在單位名稱及代碼按單位公章填寫全稱。例如“中國科學院西安光學精密機械研究所”不得填“中科院西安光機所”或“西安光機所”。全稱中的數(shù)字，一律寫中文，例如：中國航天工業(yè)總公司第七一所。首次申請國家自然科學基金的單位，尚未編入單位代碼，其代碼暫不填寫。參加單位數(shù)指研究項目組主要成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯數(shù)字表示。項目組主要成員指在項目組內(nèi)對學術思想、技術路線的制訂與理論分析及對項目的完成起重要作用的人員，本人應在申請書上親自簽名。本欄雙線右側內(nèi)容不輸入計算機。研究內(nèi)容和意義摘要與主題詞均錄入軟盤。研究內(nèi)容和意義摘要

6、通過msc體外培養(yǎng)，轉化為神經(jīng)干細胞，進而基因轉染，體內(nèi)移植，誘導分化等方法探索對先天性巨結腸癥動物無神經(jīng)節(jié)細胞段進行神經(jīng)支配重建的途徑和效果。本研究的完成將采用細胞工程原理和方法代替手術方法,從根本上改進先天性巨結腸癥的治療及預后，豐富臨床神經(jīng)生物學的發(fā)展。主題詞1. 主題詞數(shù)量不多于三個；2. 主題詞之間空一格（英文用/分隔）。中文msc神經(jīng)干細胞先天性巨結腸癥英文mesenchymal stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel2二、立論依據(jù)（包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處）對基礎研究，著重結合國際

7、科學發(fā)展趨勢，論述項目的科學意義；對應用基礎研究，著重結合學科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應用前景。先天性巨結腸癥（hirschsprungs disease，hd）是小兒外科領域內(nèi)的一種常見性疾病，發(fā)病率為 1/20001/5000。對 hd 臨床及基礎研究一直是小兒外科研究的熱點之一。此疾病的發(fā)生是由于多種原因使胚胎期神經(jīng)嵴細胞在消化道移行受阻，結腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細胞缺如，病變結腸痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴張形成巨結腸，影響兒童健康成長。自發(fā)現(xiàn) hd 的病因以來，hd 的治療主要依靠手術切除遠端無神經(jīng)節(jié)細胞段，手術方式較多，由于各種術式固有缺陷，目前

8、仍存在各種并發(fā)癥，影響 hd 患兒術后恢復。尋求更為有效及安全的針對 hd 的治療方法，一直是國內(nèi)外小兒外科工作者努力的方向。在臨床及科研工作中我們注意到細胞療法（ cell therapy）近年來已成為治療多種疾病的新策略，在替代，修復或加強受損的組織或器官的生物學功能方面有巨大作用。細胞療法中應用的靶細胞之一，神經(jīng)干細胞，目前已成為研究熱點。傳統(tǒng)的發(fā)生生物學認為人體神經(jīng)細胞一經(jīng)受損就永遠不能再生新的神經(jīng)元。然而隨著神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)，受損神經(jīng)細胞不能恢復的觀點正在發(fā)生變化。神經(jīng)干細胞是一種終身具有自我更新能力的細胞，其子細胞能分化產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的各類細胞，干細胞通過不對稱分裂產(chǎn)生一個祖細胞和另

9、一個干細胞，祖細胞具有有限的自我更新能力，并自發(fā)分化產(chǎn)生成神經(jīng)元細胞和成膠質細胞等，從而生成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞。已有研究表明神經(jīng)干細胞具有潛在多向分化能力，能在一定條件下定向分化，具有較強的增殖能力，移植入成體神經(jīng)組織后易于存活，目前神經(jīng)干細胞在損傷神經(jīng)組織，細胞的修復方面已顯示出良好的應用前景2。hd 病因為胚胎早期神經(jīng)嵴細胞移行受阻的結果，以往我們對 hd 的研究中也發(fā)現(xiàn) hd病變腸段不僅存在神經(jīng)節(jié)細胞異常，神經(jīng)膠質細胞也表現(xiàn)出異常，進一步支持了 hd 病因系胚胎早期神經(jīng)嵴細胞移行異常的結果。對于這種病變腸段無神經(jīng)節(jié)的異常神經(jīng)支配可否通 過神經(jīng)干細胞進行移植修復呢？ 結論是肯定的，nat

10、arajan 等在體外實驗中觀察到正支配，且前瞻性地指出了神經(jīng)嵴細胞移植可能成為今后先天性巨結腸癥的治療手段3 。目前的問題是在臨床實踐中診斷的 hd 患兒均在出生后，此刻神經(jīng)嵴細胞分化成熟，3-1常鼠的神經(jīng)嵴細胞可在體外修復培養(yǎng)中的ret.k突變鼠(一種hd動物模型)病變腸段神經(jīng)且此類患兒病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結締組織的增生等細胞外基質變化，單純的神經(jīng)嵴細胞移植一方面神經(jīng)嵴細胞來源受限，另一方面能否在體內(nèi)改造病變腸段的病理變化，仍需進一步研究。近年來干細胞的基因修飾治療發(fā)展較快，國外有人發(fā)現(xiàn)將表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)干細胞直接種植于受傷的腦組織中，能促進神經(jīng)功能的恢復。神經(jīng)

11、干細胞在受到堿性成纖維細胞因子（fgf-2）和上皮細胞生長因子（egf）刺激時可分化出神經(jīng)元和膠質細胞，egf 可維持神經(jīng)干細胞的生成，fgf-2 對干細胞的分化起重要作用；有很多神經(jīng)因子（如血小板生長因子，轉化生長因子等）對神經(jīng)干細胞的分化起著協(xié)同作用。誘導分化劑維3平滑肌，結締組織的增生等變化的現(xiàn)象，我們注意到纖溶酶原激活因子（pa）能激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，及細胞外基質中的纖連蛋白(fibronectin, fn)，層粘連蛋白（laminin，ln），基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, mmp）能分解周圍組織細胞外基質，如將 pa，mmp

12、 的 cdna 轉染修飾神經(jīng)干細胞將有可能對 hd 病變段的病理變化進行改造，有利于神經(jīng)干細胞生長，發(fā)育。通過探索影響神經(jīng)干細胞移植，生長，分化的分子機制，結合基因工程技術，將可為神經(jīng)干細胞移植治療成功創(chuàng)造條件。鑒于神經(jīng)干細胞的多向分化潛能，在大腦，脊髓中的損傷修復研究中令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)，自體造血干細胞等分化為神經(jīng)干細胞可能性的提出4 （此將為神經(jīng)干細胞自體移植提供一個很好的來源），以及神經(jīng)干細胞目前被認為是一種更優(yōu)于成纖維細胞的基因治療的載體細胞5，針對上面的問題我們提出如下假說：如同神經(jīng)干細胞移植在恢復受損大腦，脊 髓神 經(jīng)功 能上 具有 良好 的應 用前 景一 樣， 通過 各種 人工 方法

13、 修飾 后， 神經(jīng) 干細 胞移 植有 恢復 hd 病變腸段的正常神經(jīng)支配的可能。細胞移植雖然已被認為對于修復神經(jīng)組織是有效的治療方法，但目前使用的細胞多取自胚胎，這樣一方面細胞來源有限，另一方面存在異體免疫排斥作用。神經(jīng)干細胞可以在體外大量增殖，但目前主要在海馬和室管膜下層發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)干細胞分布，這樣造成了神經(jīng)干細胞來源困難。骨髓中有兩類干細胞，即造血干細胞和間充質干細胞（mesenchymal stem cell, msc）。前者的移植已成功用于臨床治療白血病，但其移植需要獲得足夠數(shù)量的造血干細胞，并且造血干細胞體外擴增存在困難。msc 易于從骨髓中分離，體外擴增簡單，長期培養(yǎng)過程中能保持多向

14、分化潛能。近期美國學者 woodbury 等在體外實驗中成功地將源于成年大鼠及人骨髓 msc 轉化為神經(jīng)干細胞, 并進而分化為神經(jīng)63-2甲酸對神經(jīng)干細胞也有誘導分化作用。對于hd病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道元。此研究結果很好地解決了神經(jīng)干細胞來源困難的問題，為今后神經(jīng)干細移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下了基礎?？傊S著當今干細胞研究的深入，探索通過 msc 轉化為神經(jīng)干細胞恢復小兒外科常見疾?。ㄏ忍煨跃藿Y腸癥）正常神經(jīng)支配的方法具有重要現(xiàn)實性及可能性。美國時代周刊曾將人類胚胎干細胞（es 細胞）和胚胎生殖細胞（eg 細胞）建系研究成功列為 20 世紀末世界十大科技成就之首，并認為 es

15、細胞和人類基因組將同時成為新世紀最具發(fā)展和應用前景的領域。由此激發(fā)了人們對 es 細胞，骨髓干細胞，神經(jīng)干細胞定向分化的研究。將 msc,神經(jīng)干細胞定向分化，移植的研究引入到 hd 這一小兒外科常見病的治療研究中，探索 msc，神經(jīng)干細胞克隆、定向分化、移植對于 hd 治療方法，可為發(fā)育生物學積累寶貴的資料；采用細胞工程原理和方法，通過 msc，神經(jīng)干細胞移植重建 hd 病變段的正常神經(jīng)支配方法的研究成功，在臨床上將可以讓 hd 患兒免于手術，使 hd 的治療發(fā)生根本性的改觀。該課題的完成除能為兒童的健康成長做出巨大貢獻，并能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的發(fā)展，提高本地區(qū)小兒外科在國內(nèi)及國際上的

16、地位，為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順利進行貢獻力量。參考文獻(1) 陳雷玲，胡廷澤，朗詩明，等。320 例先天性巨結腸癥的診斷與治療分析。華西醫(yī)科大學學報，2000，31(2)：274-27(2) kathryn s. embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons.lancet, 2000, 355 (9218): 1890(3) mccaffery p, drager uc. regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous

17、system: a master differentiation factor. cytokine growth factor rev. 2000, 11(3):233-249(4) natarajan d, grigoriou m, marcos-gutierrez cv, et al. multipotential progenitors ofthemammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organculture. development, 1999,126:157-168(5)

18、 劉平，盧亦成，朱誠。中樞神經(jīng)干細胞。中華神經(jīng)外科雜志。2000，16（3）：196-198(6) woodbury d, schwarz ej, prockop dj, et al. ault rat and human bone marrow stromalcells differentiate into neurons. j neurosci res, 2000, 61(4): 364-3703-3三、研究方案1. 研究目標、研究內(nèi)容和擬解決的關鍵問題研究目標：探索建立針對先天性巨結腸癥的 msc，神經(jīng)干細胞移植治療方法。研究內(nèi)容：msc 的分離，體外克??；msc 向神經(jīng)干細胞的轉化；多

19、種人工修飾條件下的神經(jīng)干細胞在 hd 動物模型（lethal spotted rat, ls/ls）無神經(jīng)節(jié)細胞腸段移植，定向分化；鑒定神經(jīng)干細胞移植后 hd 動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及機能。擬解決的關鍵問題：msc 向神經(jīng)干細胞的轉化；神經(jīng)干細胞的基因修飾；神經(jīng)干細胞移植，定向分化的分子機制。42.擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析研究方法：無血清培養(yǎng)，單細胞克隆技術；mrna 差異消減顯示技術；原位雜交；rt-pcr，免疫組化技術，透射電鏡技術；基因轉染技術。技術路線：建立 hd 動物模型msc 的分離及體外培養(yǎng)msc 向神經(jīng)干細胞的轉化神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)，克?。╲-my

20、c，egf 等多種基因轉染，修飾）神經(jīng)干細胞移植到 hd 動物無神經(jīng)節(jié)細胞段誘導分化（維甲酸等）mrna 差異消減顯示技術顯示神經(jīng)干細胞移植分化的分子機制觀察無神經(jīng)節(jié)細胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及功能獲得通過 msc、神經(jīng)干細胞移植對先天性巨結腸癥腸道神經(jīng)組織重建的方法5-1實驗方案：第一部分：建立 hd 動物大鼠參照文獻進行大鼠選育，源于 wistar-imamichi ar 系，hd 大鼠均結腸造瘺處理。第二部分：msc 分離培養(yǎng)，向神經(jīng)干細胞轉化1. msc 分離培養(yǎng)切取鼠一側股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取細胞培養(yǎng)液（dmem/20%fbs），反復多次沖洗出骨髓細胞，用吸管反復抽吸后，ficol

21、l 分離液離心分離出有核細細胞，移入 t-75 培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)，第二日將懸浮細胞移去（貼壁細胞為較純的基質干細胞），3-4 天更換培養(yǎng)液，當細胞融合時用胰島素/edta（trypsin/edta）處理，收獲貼壁細胞為 msc ( msc 鑒定選用 cd29，cd90，cd106 等標記)。2. msc 向神經(jīng)干細胞轉化參照文獻在 msc 培養(yǎng)液中加入脊索中胚層浸出液，脊索中胚層條件培養(yǎng)液，星形膠質細胞上清液，多種神經(jīng)生長因子等。3. 鑒定a. 光鏡及電鏡下觀察轉化細胞形態(tài)改變。b. 免疫組化或流式細胞儀檢測細胞轉化后的表面標志: nestin,波形蛋白，rc 抗原。第三部分：神經(jīng)干細胞分離提

22、取，體外培養(yǎng)，基因轉染1. 神經(jīng)干細胞的分離和傳代分別取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織，吸管吹打機械分離制成單細胞懸液，利用 dmem/f12(1:1) 加 b27 及 bfgf 無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)，具體參見文獻。2. 體外基因轉染對于以上兩種來源的神經(jīng)干細胞采用脂質體介導基因轉染技術，將 v-myc，egf，及 fgf-2 ，pa，mmp cdna 重組逆轉錄病毒載體導入神經(jīng)干細胞，包括雙基因及單基因轉染的多種形式。逆轉錄病毒載體 plncxe 由中國醫(yī)學科學院分子生物學國家重點實驗室提供。e. coli 質粒 dna 大量制備、純化和酶切參照 sambrook 等的文獻方法進行；按 lipo

23、fectaminetm 試劑盒說明進行轉染實驗。第四部分：神經(jīng)干細胞在無神經(jīng)節(jié)細胞段的移植，定向分化及檢測5-21.神經(jīng)干細胞在 hd 動物模型體內(nèi)移植按多種組合形式，利用毛細顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉染的神經(jīng)干細胞注射到 hd 無神經(jīng)節(jié)細胞段；參考文獻報道進行，將注射細胞濃度定為 0.5-1 cell/ 0.5ul。2.移植后的神經(jīng)干細胞在 hd 動物體內(nèi)的分化誘導劑處理，藥物濃度選擇參考文獻。維甲酸等分化誘導3.移植后的神經(jīng)干細胞對 hd 動物模型無神經(jīng)節(jié)細胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響檢測a實驗動物的處理：將實驗組鼠（包括對照組）分別于不同時期斷頸處死，如移植后 4 周，16 周，32 周。取移

24、植處腸組織進行檢測，分別按進行檢測的項目要求對樣本進行處理。光鏡及電鏡檢測移植處組織形態(tài)學變化。免疫組化技術：檢測神經(jīng)細胞特異性烯醇化酶（ nse），-100，gafp 等表達。原位雜交，rt-pcr 檢測：轉染基因的表達（v-myc，egf 等），原位雜交所需探針，rt-pcr 引物可分別購自中山，gibic 公司，按說明進行實驗操作。功能鑒定：直腸測壓技術，生物化學方法檢測 r-氨基丁酸，p 物質等的合成。4.神經(jīng)干細胞移植，分化的分子機制參照文獻利用 mrna 差異消減顯示技術顯示以上多種形式神經(jīng)干細胞移植，分化的差異基因，進而進行分級分段克隆。a.b.神經(jīng)干細胞移植處腸段及相同部位正常

25、腸神經(jīng)組織 rna 的純化：利用腸道組織的剝片技術獲取腸神經(jīng)組織，立即置放于液氮中，-70 保存。氯仿法提取 rna，dnase i 處理，紫外分光度計定量測定。rt-pcr 差異消減顯示：對分別將神經(jīng)干細胞移植處腸段及相同部、 、錨定引物，對 cdna 進行大量擴增，正常腸神經(jīng)組織用生物素標記的 datp 和 dntps 進行 pcr 擴增，產(chǎn)物進行消減雜交，用連親和素去除共有產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有-32 pdatp 的 dntps 進5-3位正常腸神經(jīng)組織分離擴增出cdna，運用5端帽子引物與3端行 pcr，在重復差異顯示，回收差異條帶并克隆。（0.4ul rna，。37。c 溫育 10m

26、in，加 200u/ulmomulv 反轉錄酶，37。c 溫育 50min，。ta 克隆盒進行 dna 克隆，按說明進行，及進行測序，基因鑒定等）。5.結合步驟 3 的檢測結果再進行神經(jīng)干細胞的基因轉染體外基因轉染。同第三部份的6.獲得神經(jīng)干細胞基因轉染，移植，分化，重建 hd 正常神經(jīng)支配的方案重復步驟 1；2；3；4，反復調整。第五部分：統(tǒng)計分析各實驗組間的數(shù)據(jù)以 均數(shù) 標準差表示，用 f 檢驗，t 檢驗，多因素方差分析進行多組及組間統(tǒng)計學處理，p 值小于 0.05 為差異顯著?？尚行苑治觯?1)(2)(3)(4)(5)(6)msc 分離，體外培養(yǎng)，本課題組已經(jīng)完成。本課題組已前期進行了

27、msc 轉化為神經(jīng)干細胞的實驗，同時成功進行了體內(nèi)神經(jīng)干細胞的分離并獲得了國家自然科學基金支助（編號 30070382）。神經(jīng)干細胞移植為當今各國神經(jīng)細胞工程研究重點，大量的研究文獻報道了神經(jīng)干細胞分離，培養(yǎng)的方法。較其它一些干細胞研究不同，神經(jīng)干細胞有明確的免疫標記。在臨床及研究中對大量先天性巨結腸癥進行了觀察，有多篇相關文獻發(fā)表。課題組已成功進行了神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定，及成人骨髓 msc 體外擴增和定向誘導分化為骨和軟骨細胞。5-41逆轉錄緩沖液，15umol/ldntp,10umol/l簡并引物，65c5min，95c溫育5min，pcr，消減雜交，過柱子，pcr，消減雜交，3本項

28、目的創(chuàng)新之處（1）（2）以往對神經(jīng)干細胞移植的研究主要局于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓損傷修復方面，雖然有類似于神經(jīng)干細胞的神經(jīng)嵴細胞修復腸神經(jīng)節(jié)缺如的文章報道，但神經(jīng)干細胞移植修復腸神經(jīng)節(jié)缺如尚未見報道。首次提出 msc 轉化為神經(jīng)干細胞后，移植分化修復 hd 正常神經(jīng)支配可能。4. 年度研究計劃及預測進展（1）（2）（3）（4）2002 年 1 月2002 年 12 月構建 hd 動物模型及初步完成 msc 分離，體外培養(yǎng)，及向神經(jīng)干細胞轉化。2003 年 1 月2003 年 12 月完成神經(jīng)干細胞的各種基因轉染實驗，初步完成 hd 動物模型的無神經(jīng)節(jié)細胞段的神經(jīng)干細胞注射及檢測。2004 年 1

29、月2004 年 6 月進一步完成 hd 動物模型的無神經(jīng)節(jié)細胞段的神經(jīng)干細胞注射及檢測，獲得 msc 轉化為神經(jīng)干細胞后移植分化重建 hd 正常神經(jīng)支配的方法。2004 年 6 月2004 年 12 月數(shù)據(jù)處理，完成論文。5. 預期研究成果以論文發(fā)表作為研究成果。6四、研究基礎1. 與本項目有關的研究工作積累和已取得的研究工作成績（1）本項目的提出源于課題組對先天性巨結腸癥長期的臨床及基礎研究，既往主要將注意力集中在手術方法的改進，病理生理學變化觀察上，已有多篇相關文章發(fā)表。（2）本課題組對多個年齡組的正常個體及先天性巨結腸癥患者進行了神經(jīng)節(jié)發(fā)育觀測，并對人巨細胞病毒與先天性巨結腸癥的關系進行

30、了研究。（3）對數(shù)百例先天性巨結腸癥患者進行了診治，有較豐富的臨床經(jīng)驗。（4）已成功地建立了神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)。（5）本課題組成員已進行了 msc 轉化為神經(jīng)干細胞的實驗，并獲得了國家自然科學基金資助（編號 30070382）。（6）本課題組較熟練地掌握了基因轉染技術，效果優(yōu)良。2. 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況）本研究室所在的重慶醫(yī)科大學兒科研究所為原四川省重點實驗室，現(xiàn)已重新評定為重慶直轄市重點實驗室，目前正在申報國家級及教育部重點實驗室，是博士授權點并可培養(yǎng)博士后人員。有高級職稱人員 100 多人。兒科研究所專業(yè)門

31、類齊全，技術力量雄厚，設備完善，具有包括中心實驗室在內(nèi)的涉及分子生物學、分子遺傳學、細胞生物學、組織病理學、生物化學、免疫學、微生物學以及急救醫(yī)學、小兒腫瘤實驗外科學等專業(yè)實驗室、研究室十余個，能承擔國家重點科研課題及博士后研究工作。多年來，已完成包括國家自然科學基金資助項目在內(nèi)的部、委、省、市級科研課題上百項，并獲多項各級獎勵。主要設備及實驗條件包括：掃描、透射電鏡高壓液相色譜儀顯微成像系統(tǒng)石蠟，冷凍，恒冷，超薄切片機熒光，相差，倒置，自動照相顯微鏡pcr 儀7-1細胞培養(yǎng)全套設備熒光分光光度計紫外分光光度計 lkb電泳儀器 低溫超速離心機 超低溫冰箱，低溫冰柜 超聲細胞粉碎儀 去離子水發(fā)生

32、器 分子生物學實驗常用設備 動物實驗檢測維持設施 二氧化碳孵箱 其他輔助設備 其它本次實驗需要，但缺少的設備，如 dna 測序分析儀等可通過測序公司解決或聯(lián)系國家干細胞研究重點實驗室解決。7-2申請者和項目組主要成員的學歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關的主要論著目錄*和獲得學術獎勵情況及在本項目中承擔的任務；青年科學基金申請者還應注明學位論文名稱及導師姓名與工作單位* 論文：作者題目刊名年份卷（期）頁碼專著：作者書名出版者年份8-18-3五、經(jīng)費預算支 出 科 目金 額（萬元）計 算 根 據(jù) 及 理 由1. 合 計2 1 . 31科研業(yè)務費3.5資料費0.5資料檢索及查新等學術交流費1

33、.0發(fā)表論文等成果鑒定費2.02實驗材料費1616.8實驗動物及飼養(yǎng)2.1wistar-imamichi ar 系選育生物試劑及化學試劑3.5nestin，及 v-myc，egf，fgf-2 等 cdna 的構建等多種消耗性材料費3.3引物合成2.3cdna 測序2.5多種生長因子3.13項目組織費1 . 0注: 預算支出科目按下列順序填寫: 1. 科研業(yè)務費2. 實驗材料費3. 儀器設備費4. 實驗室改裝費5. 協(xié)作費6. 項目組織實施費。開支范圍詳見國家自然科學基金資助項目財務管理辦法第二章。9六、申請者正在承擔的其它研究項目（攀登計劃、863 計劃、攻關任務和各部委、省市任務等項目的名稱

34、及編號、任務來源、起止年月、負責或參加以及與本申請項目的關系等情況）七、申請者承擔（負責或參加）國家自然科學基金資助項目的情況批準號項目名稱起止年月負責或參加進展或完成情況10對申請者負責的前一個已結題科學基金資助項目（項目名稱及批準號）完成情況，后繼研究進展及與本申請項目的關系加以詳細說明。另附該已結題項目研究工作總結摘要（300 字）及已發(fā)表主要相關論文首頁復印件（限三篇）。八、申請者承諾我保證上述填報內(nèi)容的真實性。如果獲得資助，我與本項目組成員將嚴格遵守國家自然科學基金委員會的有關規(guī)定，切實保證研究工作時間，按計劃認真開展研究工作，按時報送有關材料。申請者（簽章）11年月日九、推薦意見（不具有高級專業(yè)技術職務的申請者，須有兩名具有高級專業(yè)技術職務的同行專家推薦。推薦時，請認真負責地介紹申請者及其項目組成員的業(yè)務基礎、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。項目組成員不能做推薦者）推薦者（簽章）所在單位：推薦者（簽章）專業(yè)技術職務專業(yè)技術職務專長專長所在單位：12十、申請者所在單位及合作單位的審查與保證1.申請者所在單位學術委員會的審查意見（包括：對項目的意義、特色和創(chuàng)新之處及申請者的研究水平與學風簽署具體意見