酶工程實驗報告四(纖維素酶酶促反應(yīng)初速度的測定)

1、本科學生實驗報告僅供參考責任自負學號 104120440 姓 名 孫 永 升 學院 生命科學學院 專業(yè)、班級 10生物技術(shù) 實驗課程名稱 酶 工 程 教師及職稱 李 俊 俊 開課學期 2012 至 2013 學年 第二學期 填報時間 2013 年 5 月 8 日 云南師范大學教務(wù)處編印實驗名稱實驗方式小組成員實驗四：纖維素酶酶促反應(yīng)初速度的測定小組合作XXXXXXXX1、 實驗?zāi)康那蟪鲈谝欢l件下測定酶活力的初速度時間范圍，并了解它的意義，了解濃度度對曲線的影響。2、 實驗儀器、試劑和溶液：2.1 儀器：紫外分光光度計、比色皿（3個）、恒溫水浴鍋、試管架（1個）、l移液管、洗耳球、標簽（若干）

2、、分析天平（感量0.01mg）等。2 .2 試劑和溶液2 .2.1 檸檬酸鈉緩沖液，0.05mol/L，pH4.82 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）2 .2.3 DNS試劑（CMCA-DNS）2 .2.4 纖維素酶液3、實驗原理或裝置示意圖：原理: 產(chǎn)物生成量與時間的關(guān)系曲線稱為酶反應(yīng)的進程曲線。曲線的斜率就是酶反應(yīng)過程中的反應(yīng)速度。在一定時間內(nèi)反應(yīng)速度維持恒定，但隨著時間的延續(xù)，反應(yīng)速度逐漸降低。這是由于：底物濃度的降低，產(chǎn)物濃度的增加加速了逆反應(yīng)進行；產(chǎn)物的抑制作用，產(chǎn)物的積累導致pH改變；酶會部分失活。因此，為了準確表示酶的反應(yīng)速度就必須采用初速度維持恒定的速度。

3、在酶活力測定時，一般應(yīng)先做進程曲線，然后再求出代表初速度的反應(yīng)時間范圍。本實驗采用最適pH、最適溫度和足夠高的底物濃度，來測定不同酶濃度下反應(yīng)速度的時間范圍。4、實驗方法步驟、操作流程及注意事項：4 .1 實驗方法與步驟：1、 酶液制備 精確稱取固體纖維素酶0.05g 、0.1g、 0.15g 、0.2g ，分別溶于100mL蒸餾水中，制成濃度為0.5mg/mL、 1mg/mL、 1.5mg/mL、 2mg/mL的酶液。2、預(yù)熱 (1)分別取50mL的底物溶液和不同濃度的已制備好的纖維素酶酶液于250mL三角瓶中，在50 水浴中保溫10min。（2）將保溫后的酶液迅速倒入保溫后的底物溶液中，振

4、蕩混勻，并立即用秒表計時，在50 水浴中繼續(xù)保溫。3、測定步驟 （1）保溫時間：3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 20min、 25min、 30min、 40min、 50min、 60min。 （2）保溫到不同的時間時，迅速取2mL反應(yīng)液于裝有3mLDNS試劑的25mL試管中（取兩次，每次時間間隔相同），迅速振蕩均勻。（3）將兩支試管沸水浴5min，自來水冷卻后，加蒸餾水20mL。搖勻，在540nm處讀取OD值。（4）空白管：在25mL試管中依次加入1mL底物溶液、 3mLDNS、 1mL對應(yīng)濃度的酶溶液。（注意：每次加入溶液時均需充分混合均勻）注意：原酶液的

5、稀釋對于測定反應(yīng)初速度進程曲線很關(guān)鍵，四種酶液稀釋濃度的OD值控制在01之間。本實驗在纖維素酶最適反應(yīng)條件50、pH 4.8 下測定不同濃度下纖維素酶反應(yīng)初速度值。4.2 操作流程： A 制備不同濃度酶液B 預(yù)熱 50mL的底物溶液 纖維素酶酶液于250mL三角瓶中 C 50 水浴中保溫10min D 保溫后底物與酶液反應(yīng)將酶液迅速倒入底物溶液振蕩混勻，立即用秒表計時于50 水浴中繼續(xù)保溫 E 不同時間保溫3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、 60min。迅速取2mL反應(yīng)液于裝有3mLDNS試劑的25mL試管中（取兩

6、次，每次時間間隔相同），迅速振蕩均勻保溫不同時間：F 測定 反應(yīng)終止 沸水浴5min 定容至25ml 測定OD540吸光值流水冷卻后，加蒸餾水20mL?？瞻坠埽涸?5mL試管中依次加入1mL底物溶液、 3mLDN、 1mL對應(yīng)濃度的酶溶液。時間時，迅速取2mL反應(yīng)液于裝有3mLDNS試劑的25mL試管中（取兩次，每次時間間隔相同），迅速振蕩均勻。 G 作酶反應(yīng)進程曲線4.3 實驗注意事項 反應(yīng)溫度準確，酶液準確稀釋。不同pH所用酶液用對應(yīng)pH緩沖液稀釋試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；移液管使用時量取精準，保證結(jié)果可靠準確。精確記時：每一管加入酶液的時間要做記

7、錄，每管之間間隔的時間要合理；避免試管進水：煮沸和用流水沖洗時；5、實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)處理：5.1實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果：如表一OD540值時間 (min)酶濃度mg/ml 0.20.40.60.830.39950.26750.52600.711560.65600.34050.72901.064090.81700.54751.00101.2330120.93800.66101.13701.2730151.01200.70801.15601.2930201.09700.81551.29301.4340251.16900.90301.36201.5520301.23700.87951.42351.562040

8、1.29400.97351.52301.6180501.35801.01351.59551.6860601.41601.05051.62451.7900表一5.2結(jié)果處理 以反應(yīng)時間為橫坐標，以相對反應(yīng)速度（吸光度值）為縱坐標，做出四種酶濃度的進程曲線，求出各種酶濃度下的初速度時間范圍和反應(yīng)初速度。統(tǒng)計軟件SPSS作圖分析如圖一 、圖二： 纖維素酶反應(yīng)的速度曲線圖一 圖二由圖一 、圖二發(fā)現(xiàn),同一種酶的不同濃度具有不同的斜率。所測纖維素四種酶濃度的動力學曲線雖然是非直線,但在325 min 呈線性關(guān)系。且各自線性關(guān)系不同。不同酶濃度的反應(yīng)初速度時間范圍和反應(yīng)初速度如下表一所示。表一 不同酶濃度的

9、反應(yīng)初速度時間范圍和反應(yīng)初速度酶濃度（mg/ml） 反應(yīng)初速度時間范圍（min） 線性關(guān)系 反應(yīng)初速度（v）0.2 330 y=0.0279x+0.4968 0.02790.4 312 y=0.0463x+0.1073 0.04630.6 312 y=0.0702x+0.3220 0.07020.8 3 9 y=0.0869x+0.4813 0.0869綜合上表可得出結(jié)論：反應(yīng)速度隨著反應(yīng)時間的延長, 酶反應(yīng)速度下降。這主要是因為隨著反應(yīng)的進行, 底物濃度降低, 產(chǎn)物濃度增加, 從而加速了逆反應(yīng)的進行。因此,為準確地表示酶活力, 需采用初速度來表示, 試驗結(jié)果證明四種不同纖維素酶濃度酶促反應(yīng)時

10、間在為30 min 內(nèi)較好1。6、 分析與討論：6.1分析 酶促反應(yīng)中反應(yīng)初速度又稱初速率(initial rate)，是酶促反應(yīng)最初階段的反應(yīng)速度。它是衡量整個酶促反應(yīng)的速度，用產(chǎn)物生成量與時間的關(guān)系曲線稱為酶反應(yīng)的進程曲線。曲線的斜率就是酶反應(yīng)過程中的反應(yīng)速度。此階段特點：(1)酶反應(yīng)速度保持恒定不變；(2)底物濃度沒有明顯減少，通常指5%的底物被利用；(3)產(chǎn)物濃度非常低；(4)逆反應(yīng)可忽略不計。通過酶反應(yīng)的進程曲線，在一定時間內(nèi)反應(yīng)速度維持恒定，但隨著時間的延續(xù)，反應(yīng)速度逐漸降低。這是由于：底物濃度的降低，產(chǎn)物濃度的增加加速了逆反應(yīng)進行；產(chǎn)物的抑制作用，產(chǎn)物的積累導致pH改變；酶會部分

11、失活。我們可以得到酶在各個時間范圍內(nèi)的反應(yīng)速度，由曲線走勢最為關(guān)鍵的是得到不同濃度下纖維素酶的反應(yīng)初速度，來準確表示酶的反應(yīng)速度。6.2討論 從實驗結(jié)果表一可以看出不同酶濃度的反應(yīng)初速度時間范圍與反應(yīng)初速度差異極大，實驗中用同一纖維素酶測定其不同濃度反應(yīng)進程曲線，纖維素酶濃度0.2 mg/ml，0.4 mg/ml，0.6mg/ml，0.8 mg/ml，實驗中采用最適pH、最適溫度和足夠高的底物濃度，采用比色法求得還原糖的濃度, 生成的葡萄糖的含量與所測的吸光度成正比2。因此隨酶濃度增加曲線應(yīng)該逐漸升高，0.4 mg/ml測定時可能存在系統(tǒng)誤差，如溫度、酶液稱取與稀釋未達要求等操作失誤，導致曲線

12、最低，結(jié)果不可靠。除次，在最適條件下隨纖維素酶濃度升高反應(yīng)初速度時間范圍呈現(xiàn)降低趨勢，反應(yīng)初速度不斷升高。四種濃度纖維素酶的酶促反應(yīng)時間在為30 min 內(nèi)較線性關(guān)系極好，因此反應(yīng)初速度表時間范圍在30分鐘內(nèi)3。由測定結(jié)果可見，在一定的溫度條件下，一定酶液用量（濃度）和酶反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響較大，其中 酶液用量與底物濃度的影響都遵循反應(yīng)動力學原理。在底物濃度較低時，酶反應(yīng)速度與底物濃度的增加成正比關(guān)系；底物濃度過高時，由于高濃度底物的抑制作用，酶反應(yīng)速度反而會下降。 酶解反應(yīng)時間的選擇。由酶反應(yīng)速度曲線可見，反應(yīng)速度隨著反應(yīng)時間的延長，酶反應(yīng)速度下降。這主要是因為隨著反應(yīng)進行，底物濃度降低

13、，產(chǎn)物濃度增加，從而加速了逆反應(yīng)的進行。因此，為準確地表示酶活力，需采用初速度來表示，試驗結(jié)果證明酶解時間為30min為宜。7、實驗小結(jié)：初步掌握纖維素酶酶促反應(yīng)初速度的測定方法，了解酶促反應(yīng)動力學曲線的意義。由酶促反應(yīng)的進程曲線獲得初速度反應(yīng)時間范圍和酶反應(yīng)速度表征初速度的動力學涵義。測酶活時嚴格控制影響到的因素，如反應(yīng)溫度、時間、pH等。量取固體酶液時精確，溶解稀釋做到準確無誤，減少實驗操作誤差，增加結(jié)果可信度。對反應(yīng)后的實驗結(jié)果認真仔細觀察做好記錄。養(yǎng)成科學分析問題的習慣。改進：為使結(jié)果準確，可信盡可能減少操作人為的、系統(tǒng)的不必要誤差做到：在小組做實驗種形成操作標準化、進程車間化，分工明

14、確，計時精確，終止液DNS加入迅速。量取固體酶液、蒸餾水等精確無太大偏差，溶解稀釋做到準確無誤。8、實驗思考題：（1）、 什么是酶反應(yīng)進程曲線？答：產(chǎn)物生成量與時間的關(guān)系曲線稱為酶反應(yīng)的進程曲線：縱坐標一般是生成物量或者是酶的反映速率，橫坐標可以是時間，溫度，PH，酶的濃度或底物濃度，曲線就是縱坐標隨橫坐標的變化而變化所繪制出來的，曲線的斜率就是酶反應(yīng)過程中的反應(yīng)速度。（2）、 測定酶活力時為什么要測量反應(yīng)的初速度，且常以測定產(chǎn)物增加量為宜?答：在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準確檢測，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準確測定。

15、因此一般以測定產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度較為合適. 測初速度的原因也是這個，因為只有在初速度下，才能保證底物過量，酶被完全飽和，如果用反應(yīng)中某一階段的速度的話，很難保證底物還是過量的，因為根本就不知道這種酶的反應(yīng)速度到底有多快。 （3）、為什么酶活力應(yīng)在進程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進行？答：要進行酶活力測定，首先要確定酶反應(yīng)時間，酶的反應(yīng)時間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度時間范圍內(nèi)選擇。可以通過進程曲線的制作而求出酶的初速度時間范圍。進程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時間測產(chǎn)物生成量的方法，以酶反應(yīng)時間為橫坐標，產(chǎn)物生成量為縱坐標繪制而成。從進程曲線可知，在曲線起始一段時間內(nèi)為直線，其

16、斜率代表初速度。隨反應(yīng)時間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，說明酶的反應(yīng)速度下降。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間的延長而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強等原因所致。因此，要真實反映出酶活力大小，就應(yīng)在初速度時間內(nèi)測定。求出酶反應(yīng)初速度的時間范圍是酶動力學性質(zhì)的一系列研究中的組成部分和必要前提。（4）、在酶活力測定中，如何保證測定的是酶反應(yīng)初速度？答：.底物過量：必須要保證要足夠的底物，使酶能完全發(fā)揮其催化功能。. 保證對于酶是飽和的，此時酶反應(yīng)是一級反應(yīng)，反應(yīng)速度不會隨著底物量而變化，測得就是初速度。.時間的控制：根據(jù)酶促反應(yīng)曲線可以看出，最開始曲線斜率比較大，然后趨于平緩（這種原因可能是生成的產(chǎn)物促進逆反應(yīng)或是酶失活），由此，如果測定的時間選擇不當?shù)脑?，測的速度也不是初速度，所以