細(xì)菌生理檢查法課件

1、細(xì)菌生理檢查法第二章細(xì)菌生理學(xué)檢查法細(xì)菌生理檢查法 第一節(jié)細(xì)菌的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基及種類二、細(xì)菌培養(yǎng)的條件三、細(xì)菌的接種與培養(yǎng)第二節(jié)常用培養(yǎng)基的制備一、生化試驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑二、一般培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基細(xì)菌生理檢查法一、培養(yǎng)基及種類根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分： (1)(1)通用培養(yǎng)基通用培養(yǎng)基：培養(yǎng)異氧細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；配制適合于厭氧菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基時(shí)，通常須在培養(yǎng)基中加入適量的還原劑如巰基醋酸鈉、維生素C或半胱氨酸來降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，以利于厭氧菌的生長(zhǎng)。 (2)(2)鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：是一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只需用肉眼辨別顏

2、色就能方便地從近似菌落中找出目的菌落的培養(yǎng)基。(伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂、微生物快速顯色培養(yǎng)基） (3)(3)選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌。（馬丁氏培養(yǎng)基、Ashby無氮培養(yǎng)基）有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。細(xì)菌生理檢查法根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)

3、成分是否完全了解來區(qū)分：根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分： ）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來講，營(yíng)養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長(zhǎng)旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號(hào)等因素的影響。 ）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分

4、精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長(zhǎng)緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營(yíng)養(yǎng)、代謝的研究。 ）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多。細(xì)菌生理檢查法 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分： ）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。 ）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅

5、膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。 ）半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來保藏菌種。細(xì)菌生理檢查法培養(yǎng)基制備技術(shù)培養(yǎng)基制備技術(shù) 培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長(zhǎng);因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。培養(yǎng)基的

6、分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi):液體分裝至試管1/4左右 為宜；如固體則分裝量為管高的1/5；半固體培養(yǎng)基，則分裝至試管的1/21/3為宜；錐形瓶分裝培養(yǎng)基時(shí)，容量應(yīng)不超過容積的一半為宜；9cm的培養(yǎng)皿可倒入15ml培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。 細(xì)菌生理檢查法滅菌

7、和消毒 消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營(yíng)養(yǎng)體的方法， 滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。 細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 物理方法物理方法溫度 ：利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法：這是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至1

8、60C，恒溫1小時(shí)即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。附：電熱恒溫干燥箱（俗稱附：電熱恒溫干燥箱（俗稱“烤箱烤箱”）的使用）的使用 把待滅菌的物品均勻地放入烤箱中，關(guān)上箱門，調(diào)節(jié)溫度至160C，打開電源，待溫度上升至160C時(shí)計(jì)時(shí)，維持該溫度0.5-1小時(shí)。注意：多觀察幾次溫度，防止溫度失控。用量較少的實(shí)驗(yàn)室可以做幾個(gè)鐵皮筒，蓋子側(cè)面帶孔，滅菌時(shí)將孔打開，滅菌冷卻過后將孔關(guān)閉?？梢詫⑽苊恐为?dú)用白紙包裹用脫水粘上（防止紙散開來），裝入鐵皮筒滅菌，使用時(shí)可以單獨(dú)拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以單獨(dú)用白紙包裹用脫水粘上，裝入鐵皮筒滅菌。無菌瓶可以蓋上蓋子，用用白紙包起蓋子，用棉線扎起來，

9、不可以用尼龍線，因?yàn)槟猃埦€不耐高溫，易斷。細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 物理方法物理方法濕熱滅菌法:在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因?yàn)橐环矫婕?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對(duì)蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營(yíng)養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62C，30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死

10、細(xì)菌的全部營(yíng)養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100C，1530分鐘，殺死其中的營(yíng)養(yǎng)體。然后冷卻，放入37C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時(shí)間長(zhǎng)。細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 物理方法物理方法d. 加壓蒸汽滅菌法：把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行的

11、，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點(diǎn)也隨之提高。在蒸汽壓達(dá)到1.055公斤/厘米2時(shí)，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達(dá)到121C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在1520分鐘便會(huì)被殺死，而達(dá)到滅菌目的。如滅菌的對(duì)象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。 在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個(gè)問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對(duì)應(yīng)關(guān)系，這樣會(huì)大大降低滅菌效果。附：高壓鍋的使用附：高壓鍋的使用打開鍋蓋，取出內(nèi)鍋，觀察水量，補(bǔ)充水量至比墩子略高，將需滅菌的物品放入內(nèi)鍋，蓋上蓋子，對(duì)稱旋緊螺栓，關(guān)閉放氣閥，打開電源

12、，待壓力表上指針指向0.05時(shí)打開放氣閥放冷氣，等到壓力表上指針指向0時(shí)關(guān)閉放氣閥，待壓力表上指針指向0.05時(shí)再次打開放氣閥放冷氣，等到壓力表上指針指向0時(shí)關(guān)閉放氣閥；冷氣放完后，待壓力表上指針指向0.10時(shí)打開放氣閥，等到壓力表上指針指向0時(shí)關(guān)閉放氣閥，反復(fù)放氣2-3次，最后撥下電源，不打開放氣閥，讓其自然冷卻。取物品時(shí)一定要將放氣閥打開，等到壓力表上指針指向0時(shí)方可對(duì)稱旋松螺栓，打開蓋子取出物品。 細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 物理方法物理方法影響滅菌的因素影響滅菌的因素 a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對(duì)高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)體和病毒在5065C，10分鐘就會(huì)被殺死；但各

13、種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強(qiáng)的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121C，12分鐘才被殺死。對(duì)同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對(duì)熱更敏感; b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長(zhǎng); c.培養(yǎng)基的成分與組成也會(huì)影響滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強(qiáng)，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對(duì)滅菌產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間長(zhǎng)。滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響 a.pH值普遍下降; b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會(huì)產(chǎn)生磷

14、酸鈣沉淀; c.不少培養(yǎng)基顏色加深; d.體積和濃度有所變化; e.營(yíng)養(yǎng)成分有時(shí)受到破壞。細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 物理方法物理方法輻射：利用輻射進(jìn)行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點(diǎn)，所以應(yīng)用越來越廣，目前主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面：）接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。）應(yīng)用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長(zhǎng)。過濾：采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對(duì)熱不穩(wěn)定的

15、體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定的麻煩。細(xì)菌生理檢查法滅菌和消毒 化學(xué)方法化學(xué)方法一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長(zhǎng)繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。消毒劑在低濃度時(shí)也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用，所以

16、只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。 細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 接種工具和方法 在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。接種和分離工具 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純

17、化與接種技術(shù)劃線接種： 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。細(xì)菌生理檢查法劃線接種，分離純化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies細(xì)菌生理檢查法灼燒灼燒細(xì)菌生理檢查法細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)斜面接種技術(shù)細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)細(xì)菌的涂布分離技術(shù)細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 液體接種法、穿刺接種穿刺接種液

18、體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時(shí)要求無菌操作。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵酵搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡(jiǎn)便的深

19、層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用創(chuàng)造厭氧條件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學(xué)方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的

20、方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強(qiáng)，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡(jiǎn)易，但厭氧程度低。化學(xué)方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應(yīng)時(shí)吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達(dá)到嚴(yán)格厭氧目的，常采用物理和化學(xué)相結(jié)合并用的方法。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006N NaOH 0.015% 美蘭溶液

21、6 葡萄糖溶液 上列三種溶液在使用時(shí)等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小?細(xì)菌生理檢查法微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 液體接種法、穿刺接種穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時(shí)要求無菌操作。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵酵搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺

22、層液體培養(yǎng)、液體振例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用創(chuàng)造厭氧條件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)

23、室中常用的如葡萄糖條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學(xué)方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強(qiáng)，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡(jiǎn)易，但厭氧程度低。化學(xué)方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應(yīng)時(shí)吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般

24、為達(dá)到嚴(yán)格厭氧目的，常采用物理和化學(xué)相結(jié)合并用的方法。細(xì)菌生理檢查法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006N NaOH 0.015% 美蘭溶液 6 葡萄糖溶液 上列三種溶液在使用時(shí)等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小?細(xì)菌生理檢查法 微生物細(xì)胞大小和數(shù)量的測(cè)定目的要求：學(xué)習(xí)使用目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺在顯學(xué)習(xí)使用目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺在顯微鏡下測(cè)定微生物大小的方法；學(xué)習(xí)使用血球記數(shù)微鏡下測(cè)定微生物大小的方法；學(xué)習(xí)使用血球記數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量的方法。板測(cè)定微生物數(shù)量的方法。實(shí)驗(yàn)材料：顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、細(xì)顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、細(xì)

25、菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯細(xì)菌生理檢查法測(cè)定微生物的大小測(cè)定微生物的大小測(cè)定的工具：目鏡測(cè)微尺測(cè)定的工具：目鏡測(cè)微尺 鏡臺(tái)測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺細(xì)菌生理檢查法測(cè)定微生物的大小測(cè)定微生物的大小 目鏡測(cè)微尺的校正：在高倍鏡下，看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使目鏡測(cè)微尺的0點(diǎn)與鏡臺(tái)測(cè)微尺的某一刻度重合，然后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度。計(jì)算兩刻度間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。由于鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)10

26、m，所以可得： 目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（m m）= =（鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)（鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)1010）/ /目鏡測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù) 注意：校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件（特定的接物鏡、接目鏡、鏡筒長(zhǎng)度等）進(jìn)行，而且只能在這特定的情況下才可重復(fù)使用。菌體大小的測(cè)定：取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，將細(xì)菌染色標(biāo)本置于載物臺(tái)上，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的長(zhǎng)和寬。細(xì)菌生理檢查法測(cè)定微生物數(shù)量測(cè)定微生物數(shù)量方法：活菌計(jì)數(shù)法方法：活菌計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法；總菌計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法；總菌計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板或霍瑟血球計(jì)數(shù)板或霍瑟（Peroff HausserPeroff Hausser）細(xì)菌計(jì)

27、數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而）細(xì)菌計(jì)數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。已）。 細(xì)菌生理檢查法測(cè)定微生物數(shù)量測(cè)定微生物數(shù)量本實(shí)驗(yàn)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌的數(shù)量 取清潔無油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。 取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。靜止5min后，用低倍鏡觀察并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。 高倍鏡下計(jì)數(shù)：隨機(jī)計(jì)數(shù)五個(gè)中格的平均值，然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。計(jì)算方法：注意事項(xiàng)：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側(cè)線上的菌體計(jì)入本格內(nèi)；遇到有芽體的酵母

28、時(shí)，若芽體和母體同等大，就按單個(gè)酵母計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完畢后，血球計(jì)數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。（X1+X2+X3+X4+X5）5 25（或（或16）10 1000 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 酵母菌細(xì)胞數(shù)酵母菌細(xì)胞數(shù)/mL=細(xì)菌生理檢查法細(xì)菌生理學(xué)檢查法微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長(zhǎng)出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長(zhǎng)出孢子，貼上標(biāo)簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個(gè)月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)室均采用。 缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，

29、易產(chǎn)生變異、退化缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：石蠟封藏法：在已長(zhǎng)好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細(xì)菌和放線菌。 石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。砂土管保藏法：砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細(xì)菌）。 1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10HCl后煮沸30min，除去有機(jī)質(zhì)（也可用10HCl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃

30、土若干，曬干磨細(xì)，過120目篩。 2.按 土：砂1：4 的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，1601700C干熱滅菌2h。 3.在新鮮菌種斜面上加入3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.20.3mL的菌懸液放入每個(gè)砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標(biāo)簽，注明菌名。 4.菌液加好后，立即進(jìn)行抽真空干燥，要求在24h內(nèi)抽干，尤其是夏天要求較短時(shí)間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。 冷凍真空干燥保藏法：冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細(xì)菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護(hù)劑。細(xì)菌生理檢查法細(xì)菌生理學(xué)檢查法微生物生化反應(yīng)生化反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 糖酵解試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) V-P試驗(yàn)甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)枸椽酸鹽試驗(yàn)：