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文檔簡介
1、 廣 州 大 學(xué)綜合設(shè)計性實驗報告學(xué) 院 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 課 程 細 胞 生 物 學(xué) 實 驗 實驗項目 細胞培養(yǎng) 實驗題目 小鼠肝細胞的原代培養(yǎng) 專 業(yè) 生物技術(shù) 年級、班別 生技142 姓 名 徐嘉寬 學(xué) 號 1414300030 任課教師 陳鯤 細胞培養(yǎng) 小鼠細胞的原代培養(yǎng)摘要 目的 探討體外分離和培養(yǎng)小鼠腎、腦、心肌細胞的方法。方法 采用脫臼法處死新生小鼠,結(jié)合 酶消化法和組織塊法對新生小鼠腎、腦、心肌細胞進行了體外分離、培養(yǎng)。(用眼科剪把新生小鼠心肌細胞組織剪成小于1mm³大小的植塊,然后用胰蛋白酶消化510min,最后將心肌組織塊接種于培養(yǎng)瓶中進行體外培養(yǎng)。腦和腎直
2、接進行組織塊培養(yǎng)。)結(jié)果 比較成功地進行了原代腎、腦、心肌細胞培養(yǎng),并進行了形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)論 采用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對小鼠心肌、腎、腦細胞的體外原代培養(yǎng),較好觀察到心肌、腦、腎細胞的形態(tài)。關(guān)鍵詞 原代培養(yǎng) 小鼠細胞 組織塊法 酶消化法1前 言 初步了解動物細胞原代培養(yǎng)的基本方法、原理和基本操作過程,初步掌握無菌操作方法。學(xué)習植塊培養(yǎng)法、營養(yǎng)液的配置及酸堿度的調(diào)節(jié)。細胞培養(yǎng)是當前細胞生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實驗技術(shù)。當前,細胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞工程等領(lǐng)域,已發(fā)展成為一種重要的生物技術(shù)。了解動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)的基本操作過程,觀
3、察體外培養(yǎng)細胞的生長特征,并對原代培養(yǎng)有一個基本概念。結(jié)合酶消化法和組織塊法通過無菌操作培養(yǎng)新生小鼠細胞。2實驗原理原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織或器官,經(jīng)體外培養(yǎng)后,直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng),首先用無菌操作的方法,從動物體內(nèi)取出所需的組織(或器官),用植塊培養(yǎng)法或酶解法,在人工培養(yǎng)下,使其不斷地生長及繁殖。細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要是細胞能在體外長期生長,必須滿足兩個基本要求:一是供給細胞存活所必須的條件,如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度,注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。3實驗用
4、品3.1器材 解剖剪、鑷1套;眼科剪7把、眼科鑷6把;吸管直、彎頭各7支,2 ml刻度吸管5支;吸管膠頭:小18個、大6個;細胞培養(yǎng)瓶5個;青霉素瓶及瓶塞:6個(其中一個用于分裝胰酶液);培養(yǎng)皿(用于解剖取材):大、小各1套。燒杯:510ml 2個、100 ml 1個。 用于無菌操作:解剖鑷1把,廣口瓶大、小各1個(裝消毒棉球),醫(yī)用棉花、紗布,有蓋白瓷盤1個、消毒盒3個、牛皮紙、棉繩。小培養(yǎng)皿(裝蓋玻片)1個。 3.2試劑 3.2.1清洗用液:5%稀鹽酸、1%稀鹽酸、2%NaOH、洗潔精、單蒸水、三蒸水、清洗液 (用 濃硫酸和重鉻酸鉀配制、全班共用)等。 3.2.2消毒劑(用前配制):甲醛、
5、高錳酸鉀、新潔爾滅、75%酒精、碘酒、過氧乙酸等。 3.2.3 培養(yǎng)用液: 3.2.3.1 細胞培養(yǎng)用液(每大組100mL,用100mL鹽水瓶裝):經(jīng)過濾過的F10 (RPMI1640)培養(yǎng)基占8090%、經(jīng)過濾除菌的小牛血清占1020%,加入經(jīng)過濾除菌、終 濃度各為100國際單位的抗菌素。 3.2.3.2細胞消化液(每小組1青霉素瓶,約5mL):經(jīng)過濾除菌的0.25%胰蛋白酶 或EDTA胰蛋白酶液。 3.2.3.3平衡鹽溶液:不含鈣、鎂離子的Hank液:每組約50mL,用50(或100)mL 鹽水瓶裝。3.3 材料新生白小鼠4實驗方法4.1技術(shù)路線清洗玻璃儀器,膠塞制備消毒棉球包裝分裝培養(yǎng)液
6、用液用品消毒分裝培養(yǎng)用液用品分裝培養(yǎng)用液包裝原代培養(yǎng)接種用品實驗時的準備工作如小組所示在小組其他成員已打開腹腔的基礎(chǔ)上切取小鼠腎(心肌、腦)組織塊洗去血污 剔除多余成份剪成小于1mm³大小的植塊接種貼壁培養(yǎng)觀察和記錄4.2實驗步驟a) 玻璃儀器的初步清洗、開始培育小白鼠(第一批雌鼠與雄鼠混養(yǎng)、觀察記錄陰道口的情況等)b) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠(第二批雌鼠與雄鼠混養(yǎng)、觀察記錄陰道口的情況等),玻璃儀器的清洗(清洗液浸泡)、膠制品的清洗。c) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠(常規(guī)飼養(yǎng)工作)、完成清洗工作(包括各類物品)、制備消毒用棉球、包裝分裝培養(yǎng)用液用品。d) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠(常規(guī)飼養(yǎng)工作、留意小鼠的出生)、消毒
7、分裝培養(yǎng)用液用品、分裝培養(yǎng)用液、包裝原代培養(yǎng)接種用品。e) 消毒原代培養(yǎng)接種用品f) 細胞原代培養(yǎng)(1)洗手 操作者用洗滌劑刷洗雙手自來水沖凈新潔爾滅浸泡進入無菌室 (2)準備工作: 1操作者于超凈臺內(nèi)用酒精棉球消毒雙手,待酒精稍干后,然后用酒精棉球消毒工作面。 2去掉Hank液、細胞培養(yǎng)液、酶液的包裝紙。 3打開試管、吸管膠頭包裝,將試管插(盡量斜插)入試管架 4取出需用的吸管(直、彎吸管各一支,刻度吸管一支)套上膠頭,試管一支,插入相應(yīng)的試管中。 5打開培養(yǎng)皿以及解剖工具
8、手持端的包裝 (3)處死小鼠(脫臼法) 消毒(放入含75%酒精的燒杯中浸泡數(shù)秒)。將以處死消毒的小鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)的培養(yǎng)皿蓋內(nèi),背部朝上。培養(yǎng)皿倒扣于包裝紙上待用。 (4)解剖取腎:用酒精棉球擦拭背部,在腰部后緣用解剖鑷提起皮膚,用解剖剪呈倒T形剪開皮膚,再用解剖剪剪開腰部兩側(cè)肌肉,用眼科剪拿出2個腎臟置于無菌培養(yǎng)皿中。 (5)用Hank液洗滌皮膚組織2次,吸去Hank。(6)剪碎組織塊:換另一套眼科剪將組織塊剪成小于1mm³的組織塊(大小盡量一致)。用Hank液洗滌,棄Hank液。
9、;(7)酶消化:將胰蛋白酶液加入裝有組織塊的青霉素瓶中,蓋緊蓋子,置超凈工作臺內(nèi)中消化510min,知道組織塊變松軟、粘稠狀,顏色略變白色為止。 (8)將培養(yǎng)液直接加入盛有胰蛋白酶和皮膚組織塊的青霉素瓶中,利用其中的牛血清終止酶消化的作用,棄去酶液和培養(yǎng)液的混合液。加入培養(yǎng)液重復(fù)此操作23次。 (9)取一培養(yǎng)瓶,在培養(yǎng)瓶的上面做好標志(在瓶側(cè)注明班、組別、姓名、材料名稱等信息) (10) 用培養(yǎng)液濕潤的吸管小心吸取組織塊,輕輕吹出到培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)瓶面內(nèi),按照一定
10、的間隔和形式用彎吸管將植塊排列好 (11) 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)面在上方),加入4ml的培養(yǎng)液。 (12) 將培養(yǎng)皿加蓋封口,送入37度恒溫箱內(nèi),靜置(加入的培養(yǎng)液不浸泡植塊,不從瓶口流出) (13)按相同的方法取出心臟和腦組織,清洗后直接植塊培養(yǎng)。(14) 4小時后,待組織塊充分貼壁后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使植塊浸于培養(yǎng)液中且不漂??;(15) 觀察 至于37度培養(yǎng)的細胞,需逐日進行觀察,主要觀察: 1培養(yǎng)物是否被污染,如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁,表示該瓶被污染。 2細胞生長與
11、培養(yǎng)液顏色的變化,如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色,一般細胞生長不好。可能是瓶塞未蓋緊或營養(yǎng)液pH過高。 3培養(yǎng)液若變?yōu)榻奂t色,一般表示細胞生長良好。經(jīng)過12天培養(yǎng)后,若細胞生長情況較差或培養(yǎng)液變紅了,則可換一次營養(yǎng)液。換液時也要注意無菌操作(若經(jīng)過12天培養(yǎng)后,若細胞生長情況較差或培養(yǎng)液變紅,則需換液。無菌室的準備工作如小組方案中所示:1) 從37攝氏度培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,于超凈工作臺內(nèi)吸去全部舊培養(yǎng)液;2) 用平衡鹽溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物12次,棄平衡鹽溶液;3) 加入與換液前相同的量的培養(yǎng)液;4) 放回原來的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。若經(jīng)23天后,細胞營養(yǎng)液變黃,此時表示細胞已生長。每日觀察結(jié)果用文字記錄
12、,換液也需記錄,在整個培養(yǎng)過程的不同階段(最少在前、中、后階段)置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照記錄。5結(jié)果5.1.圖片展示圖一:小鼠腎細胞圖二:小鼠腎細胞5.2.結(jié)果分析(1)小鼠腎細胞培養(yǎng) 腎臟細胞在培養(yǎng)1d后,明顯看出細胞開始向組織塊四周擴散,既有新生的細胞也有游離的組織塊碎片。翻轉(zhuǎn)組織塊能發(fā)現(xiàn)更多游離的細胞。圖一二中發(fā)亮的細胞即為有活力的腎細胞(梭形)。失去活力的細胞呈黑色或形狀不規(guī)則。圖三:小鼠神經(jīng)細胞圖四:小鼠神經(jīng)細胞(2)小鼠腦細胞培養(yǎng) 小鼠腦組織塊培養(yǎng),在初始幾天并沒有發(fā)現(xiàn)游離的神經(jīng)細胞,待培養(yǎng)液顏色變黃(證明細胞有生長)且換培養(yǎng)液后,把腦組織塊翻轉(zhuǎn),在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有一比較
13、明顯的神經(jīng)細胞(如圖四所示)。 圖五:小鼠心肌細胞 圖六:小鼠心肌細胞(3)小鼠心肌細胞培養(yǎng) 小鼠心肌細胞采用了酶消化法培養(yǎng),培養(yǎng)1d后,視野中充滿長條纖維狀物體,其中大部分為失去活力的心肌纖維細胞,呈黑色。有活力的心肌纖維形態(tài)如圖五六所示,半透明,中間有條紋間隔。因為心肌細胞生長緩慢,視野中所看到的均為游離的組織塊分離出來的細胞。6 結(jié)果分析與討論本實驗結(jié)合酶消化法和組織塊法成功地培養(yǎng)出小鼠腎細胞,并且相對單一采用酶消化法或者組織塊法細胞貼壁生長的速度要大大提高了。原因是因為皮片經(jīng)胰蛋白酶消化后,表皮很容易從真皮上分離下來。此時基底細胞聯(lián)接較松散,把組織塊放置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時,基底細胞即可輕易地游離到培養(yǎng)液中,然后在培養(yǎng)瓶底部進行貼壁生長。 而單純的組織塊培養(yǎng)沒有經(jīng)過酶消化,單個的細胞不易從組織塊上脫落,因此細胞游離出來貼壁生長的速度比較慢。因此,通過該實驗證明,經(jīng)過酶消化進行的組織塊培養(yǎng)的這種方法是一
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