基于ISSR標(biāo)記的浙江主要茶花品種親緣關(guān)系及DNA指紋圖譜研究

1、基于issr標(biāo)記的浙江主要茶花品種親緣關(guān)系及dna指紋圖譜研究正文報(bào)告一、項(xiàng)目研究意義1、浙江省茶花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r及在產(chǎn)業(yè)發(fā)展中面臨的主要問題茶花（camellia japonica）是世界名優(yōu)花卉之一，是我國(guó)的十大名貴花卉之一，也是我省金華、寧波、溫州三市的市花。我省在茶花品種的收集、培育及產(chǎn)業(yè)化示范方面已處于全國(guó)領(lǐng)先水平。1997年，金華被農(nóng)業(yè)部命名為全國(guó)唯一的中國(guó)茶花之鄉(xiāng)；2003年第十八屆國(guó)際茶花大會(huì)在金華召開，使我省茶花在國(guó)內(nèi)外都獲得了很高的知名度。2005年，全省茶花種植面積達(dá)10萬(wàn)多畝，有10多萬(wàn)花農(nóng)種植茶花，年產(chǎn)茶花800多萬(wàn)盆，培植種苗3000多萬(wàn)株，年產(chǎn)值達(dá)25億元。目前，

2、我國(guó)的茶花品種約300余個(gè)（莊瑞林，1989），其中我省茶花除原種外，在金華、寧波、溫州等地經(jīng)過長(zhǎng)期的人工栽培、雜交和選種，培育出200余個(gè)有地方特色的傳統(tǒng)茶花品種；另有國(guó)外引進(jìn)的400余個(gè)品種(高繼銀，1999)。我省近年茶花產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，但在發(fā)展中也出現(xiàn)了以下幾個(gè)問題：（1）品種混雜、譜系不明，親緣關(guān)系不清，導(dǎo)致新品種選育親本選配的盲目性大，育種效率比較低，育成品種遺傳背景趨于單一，不利于保持品種的遺傳多樣性。（2）茶花多為無(wú)性繁殖，新品種進(jìn)入市場(chǎng)后，由于缺乏有效的品種鑒別手段，難以開展技術(shù)監(jiān)督和管理，知識(shí)產(chǎn)權(quán)得不到有效的保護(hù)，大大損害了品種選育單位及育種家的積極性。（3）在種苗銷售過程中

3、，由于僅靠苗期的形態(tài)性狀難以辨別品種的真?zhèn)?，容易出現(xiàn)種苗假冒現(xiàn)象，嚴(yán)重?fù)p害花農(nóng)利益。為了盡快解決這些問題，提高浙江茶花的質(zhì)量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，應(yīng)對(duì)我省主要茶花品種間的親緣關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以減少育種過程中親本選配的盲目性，提高育種效率；同時(shí)找出一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、結(jié)果可靠的方法和技術(shù)，對(duì)山茶品種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒別，為新品種保護(hù)或假冒品種鑒別提供技術(shù)證據(jù)。 2、山茶品種間親緣關(guān)系及品種鑒別方面的研究現(xiàn)狀及issr分子標(biāo)記技術(shù)長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)有關(guān)茶花品種的研究，多集中在對(duì)茶花野生資源調(diào)查（李寶華，2003；李紀(jì)元等，2002）、資源的收集、整理、栽培技術(shù)、雜交育種（陳新年，1999）、組織培養(yǎng)、嫁

4、接繁殖等方面的研究上，對(duì)茶花品種間的親緣關(guān)系、品種鑒別一直以來(lái)都是依據(jù)其花的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理性狀(陳清炮，1992)，而在分子水平上對(duì)茶花品種間的親緣關(guān)系、遺傳分析與鑒別等方面的研究至今未見報(bào)道。目前在植物親緣關(guān)系和dna指紋圖譜研究中可以利用的有rapd、aflp、rflp和issr等多種分子標(biāo)記。但前三種標(biāo)記均存在一定的局限性，rapd的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性和重演性較低，aflp、rflp的技術(shù)要求高，成本高，難以在一般的實(shí)驗(yàn)室普及與應(yīng)用。而issr分子標(biāo)記即簡(jiǎn)單重復(fù)間序列(inter-simple sequence repeat，issr)，是在ssr標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，其基本原理是

5、在ssr的5或3端加錨l-4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列ssr的一段基因組dna序列進(jìn)行擴(kuò)增。重復(fù)序列和錨定堿基是隨機(jī)選擇的，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，每個(gè)引物可以產(chǎn)生比rapd方法更多的擴(kuò)增片段。因此，issr不僅結(jié)合了rapd的通用性，而且具有aflp、rflp的大部分優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、可靠、可以提供有關(guān)基因組豐富信息的dna指紋技術(shù)。利用issr分子標(biāo)記可以在親緣關(guān)系較近的品種間檢測(cè)遺傳差異，評(píng)估不同品種間的異質(zhì)性，計(jì)算親本之間的遺傳距離，從而確定親本之間的遺傳關(guān)系和親緣關(guān)系，并進(jìn)而劃分雜交優(yōu)勢(shì)群，提高雜種優(yōu)勢(shì)潛力；同時(shí)issr分子標(biāo)記可以用來(lái)建

6、立dna指紋圖譜，因在同一物種的各個(gè)品種間存在大量的多態(tài)性標(biāo)記，某一品種具有區(qū)別于其它品種的獨(dú)特標(biāo)記即一些特異性dna片段的組合就稱為該品種的“指紋”，各品種的獨(dú)特的指紋片段構(gòu)成該物種的dna指紋圖譜，它具有類似于人的指紋那般的高度個(gè)體特異性和穩(wěn)定性。dna指紋圖譜在植物育種中有廣泛應(yīng)用，因?yàn)椋?）每個(gè)品種dna指紋差異可直接提供與目標(biāo)性狀有關(guān)的dna水平的信息，避免了環(huán)境的干擾，從而能大大提高雜交育種中對(duì)親本及后代理想單株的選擇效率，（2）通過檢測(cè)品種是否只具有該品種特有的標(biāo)記指紋片段，可以很有效地鑒定品種純度與真?zhèn)?，以及用于新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等（鄒喻蘋等，2001）。issr標(biāo)記

7、目前已廣泛用于植物品種鑒定、親緣關(guān)系的確定（何予卿等，2001；喬玉山等，2003）、dna指紋圖譜構(gòu)建（王心宇等，2001；宣繼薛等，2002；姚明哲等，2005）、遺傳育種（張立榮等，2002）等研究中。3、利用issr分子標(biāo)記開展我省茶花主要品種的親緣關(guān)系和dna指紋圖譜研究針對(duì)我省茶花良種選育、推廣和產(chǎn)業(yè)化中存在的這些實(shí)際問題，可以采用issr分子標(biāo)記技術(shù)開展我省茶花主要品種的親緣關(guān)系研究，以明確我省茶花主要品種間的遺傳距離，為新品種選育過程中的親本選配提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)；建立dna指紋圖譜為茶花品種鑒別提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、結(jié)果可靠的方法和技術(shù)，并對(duì)我省主要的茶花品種進(jìn)行分

8、子鑒別和新品種的保護(hù)，促進(jìn)我省茶花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。二、項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系1、項(xiàng)目研究目標(biāo) 本研究以浙江省主要茶花品種為對(duì)象，利用issr分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行遺傳分析，研究其親緣關(guān)系，建立dna指紋圖譜。旨在估算茶花品種的遺傳距離，建立遺傳關(guān)系樹狀圖；同時(shí)篩選可揭示品種間差異的特異譜帶及相應(yīng)的引物和引物組合，構(gòu)建茶花品種dna的issr指紋圖譜，為我省茶花新品種選育過程中的親本選配提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)，為茶花品種分子鑒別提供一種簡(jiǎn)便、可靠的技術(shù)。2、申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系申請(qǐng)者目前主要從事山茶屬植物遺傳多樣性和分子系統(tǒng)分類的研究，博士論文就是基于its紅山茶組植物的系

9、統(tǒng)分類研究。今后長(zhǎng)期工作目標(biāo)主要是在分子水平上研究山茶的種質(zhì)資源、品種鑒定和遺傳多樣性，了解和發(fā)掘山茶花不同品種中蘊(yùn)藏的有利基因，并加以有效利用。尤其是利用issr結(jié)合其他的分子標(biāo)記開展山茶群體遺傳多樣性、基因定位、分子遺傳圖構(gòu)建的研究。因此，本項(xiàng)目是申請(qǐng)者長(zhǎng)期工作目標(biāo)的一部分，是今后工作深入開展的基礎(chǔ)。三、項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排（一）研究?jī)?nèi)容1、不同茶花品種的親緣關(guān)系研究對(duì)不同品種的茶花進(jìn)行issr-pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，估算品種間的遺傳一致度和遺傳距離，構(gòu)建遺傳關(guān)系樹狀圖。2、不同茶花品種dna指紋圖譜研究篩選可揭示品種間差異的特異譜帶及相應(yīng)的issr引物及引物組合，構(gòu)

10、建我省茶花不同品種dna指紋圖譜。 （二）研究方案研究方法和手段：1、取樣：樣本數(shù)大于30個(gè)，依據(jù)以下原則選擇供試樣品：（1）代表不同生態(tài)類型，（2）代表不同茶花類別，（3）代表不同異質(zhì)性類型，（4）具有一定的栽培面積。2、dna的提取與純化：采集新梢葉片，液氮速凍，-80保存，用改良ctab法（doyle,1987）提取樣品的基因組dna，通過凝膠回收進(jìn)行純化。3、issr引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)茶樹等近緣物種的issr引物序列信息設(shè)計(jì)與合成引物，用于issr擴(kuò)增。4、issr-pcr擴(kuò)增：根據(jù)每個(gè)issr引物的特性，設(shè)計(jì)不同的溫度梯度，根據(jù)pcr擴(kuò)增的結(jié)果篩選各引物適宜的退火溫度，優(yōu)化擴(kuò)增條件

11、。然后選擇少數(shù)（8-10個(gè)）遺傳差異較大的品種對(duì)設(shè)計(jì)合成的100條引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性進(jìn)行初步分析，篩選擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性高，擴(kuò)增效果好的引物，進(jìn)而對(duì)的所有供試樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增。5、pcr產(chǎn)物檢驗(yàn)：issr-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用8聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后用銀染法檢測(cè)，凝膠成像儀拍照記錄。6、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：對(duì)issr擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。7、譜帶分析：計(jì)算遺傳距離，用upgma發(fā)構(gòu)建品種間遺傳關(guān)系樹狀圖。8、構(gòu)建dna指紋圖譜：篩選可揭示品種間遺傳差異的特異譜帶及相應(yīng)的issr引物和引物組合，建立不同品種的dna指紋圖譜。技術(shù)路線：供試材料選擇和取樣基因組dna提取與純化issr引物的篩選issrpcr反應(yīng)

12、條件優(yōu)化供試品種的issrpcr擴(kuò)增issr擴(kuò)增譜帶統(tǒng)計(jì)與分析dna指紋庫(kù)的構(gòu)建品種親緣關(guān)系分析指導(dǎo)茶花新品選育茶花新品種分子鑒別與保護(hù)（三）擬解決的關(guān)鍵技術(shù)1、適用于茶花的issr-pcr技術(shù)的建立；2、利用issr-pcr標(biāo)記鑒別茶花不同品種的技術(shù)。（四）進(jìn)度安排1、2007年1月2007年5月：(1)確定采樣點(diǎn)，供試樣品嫩葉采集；(2)issr引物的設(shè)計(jì)與合成。2、2007年6月2007年12月：(1)基因組dna提取和純化；(2)issr-pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化；(3)多態(tài)性issr引物的初選。3、2008年1月2008年8月：(1)供試樣品的issr-pcr擴(kuò)增；(2)譜帶記錄、統(tǒng)計(jì)和

13、分析。4、2008年9月2008年12月：(1)構(gòu)建品種間的遺傳關(guān)系樹狀圖，分析品種間的親緣關(guān)系；(2)構(gòu)建dna的issr指紋圖譜；(3)撰寫論文，結(jié)題。四、項(xiàng)目創(chuàng)新之處1、應(yīng)用issr分子標(biāo)記對(duì)茶花進(jìn)行品種鑒別和親緣關(guān)系研究，引入并建立茶花品種鑒別的新技術(shù)和新方法實(shí)踐證明，分子標(biāo)記是進(jìn)行植物品種鑒別和親緣關(guān)系研究的有效工具。rapd（lee et al，1995; wachira et al，1997; 陳亮等，2002；姚明哲等，2005）、aflp（paul et al，1997; wachira et al，2001；唐紹清等，2004）和rflp（matsumoto et al,

14、2002）等分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用在和茶花同一屬的茶樹和金花茶等的遺傳關(guān)系分析上，但這些標(biāo)記均存在一定的局限性。而issr具有多態(tài)性高，重復(fù)性好，開發(fā)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、柑橘、李和茶樹等的種質(zhì)鑒定和遺傳、親緣關(guān)系和指紋圖譜研究上（zietkiewica et al，1994；fang et al，1998；blair et al，1999；aggarwal et al,1999；rrddy et al,2002；宣繼薛等，2002；freeman et al, 2004；姚明哲，2004），顯示了廣闊的應(yīng)用前景，但該技術(shù)在茶花上的應(yīng)用研究還未見報(bào)道。因此，引入issr

15、技術(shù)到茶花品種的親緣關(guān)系分析及品種鑒別的研究中并加以利用是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)，這可為茶花品種鑒別建立一種可靠、簡(jiǎn)單、低廉的新方法和新技術(shù)。2、在我省主要的茶花品種間開展較為系統(tǒng)的親緣關(guān)系的研究，并且首次對(duì)茶花的主要品種進(jìn)行dna指紋圖譜的研究，從分子水平上闡釋現(xiàn)有品種的親緣關(guān)系先前對(duì)茶花品種的研究主要在茶花的資源調(diào)查（李寶華，2003；李紀(jì)元等，2002）、栽培技術(shù)、雜交育種（陳新年，1999）上。為了深入、系統(tǒng)地了解我省茶花品種間的親緣關(guān)系，減少育種過程中親本選配的盲目性，提高育種效率，保護(hù)新品種，本研究供試品種的選擇具有廣泛性和代表性，重點(diǎn)選擇代表不同生態(tài)類型、異質(zhì)性、具有一定應(yīng)用規(guī)模的茶花品

16、種。對(duì)茶花品種間親緣關(guān)系進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，并對(duì)我省茶花的主要品種進(jìn)行dna的issr指紋圖譜的研究，在基因組水平上鑒別不同品種資源，了解和發(fā)掘蘊(yùn)藏的有利基因，并在新品種的選育和保護(hù)上加以利用。主要參考文獻(xiàn)：陳清炮. 浙江省山茶花品種分類的探討j. 園藝學(xué)報(bào), 1992，19(1)：71-75陳新年. 山茶花品種間雜交育種研究j. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999, 25(3):200-204高繼銀. 世界名貴茶花m. 杭州：浙江科技出版社. 1999何予卿，張宇，孫梅利用issr分子標(biāo)記研究栽培稻和野生稻親緣關(guān)系j農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(2)：123-127李寶華. 青島嘮山地區(qū)山茶資源調(diào)

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18、2002，19(6)：421-423姚明哲，王新超，陳亮，楊亞軍. 茶樹issrpcr反應(yīng)體系的建立j. 茶葉科學(xué)2004，24(3)：172-176姚明哲，王海濤，余繼忠，陳亮. issr在茶樹品種分子鑒別和親緣關(guān)系研究中的適用性分析. 茶葉科學(xué), 2005, 25(2)153-157張立榮，徐大慶，劉大群. ssr和issr分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用j.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(1)：90-94莊瑞林. 中國(guó)山茶m. 海南：海南人民出版社. 1989.鄒喻蘋，葛頌，王曉東. 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記m. 北京：科學(xué)出版社，2001aggarwal ak, brar

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22、lants and japanese green tea cultivars using rapd markersj. j. kor. tea soc, 1995,1(1):129-148matsumoto s, kiriiwa h, takeda y. differentiation of japanese green tea cultivars as revealed by rflp analysis of phenylalanine ammonia-lyase dnaj. theor appl genet, 2002, 104:998-1002paul s, wachira fn, po

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25、e repeat (ssr)-anchored po1ymerase chain reaction amplificationjgenomics，1994，20：176-183五、工作基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)申請(qǐng)人目前主要從事茶花的分子生物學(xué)及資源方面的研究工作。博士論文研究的是國(guó)家基金項(xiàng)目紅山茶組植物基于its序列及雜交親和性的系統(tǒng)分類研究(編號(hào)30471420)?，F(xiàn)主持寧波市科技攻關(guān)項(xiàng)目四季茶花新品種的引種與商品盆花生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究。課題組的主要成員長(zhǎng)期致力于山茶屬植物的研究，承擔(dān)并完成了國(guó)家林業(yè)局指南項(xiàng)目國(guó)外茶花種源收集及利用方法研究，國(guó)際合作項(xiàng)目山茶屬植物的系統(tǒng)調(diào)查與栽培，浙江省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目特異茶花新品種選育及其標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)研究；國(guó)家科技部農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目名優(yōu)茶花品種產(chǎn)業(yè)化示范等項(xiàng)目；出版了中國(guó)山茶、世界名貴茶花、中國(guó)名優(yōu)茶花三部專著；主要成員于2004年開始將issr分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)茶樹無(wú)性系品種進(jìn)行研究，建立了適用于茶樹的issr反應(yīng)體系，前期工作表明issr標(biāo)記具有較高水平的多態(tài)性