實驗二蛋白質(zhì)分子量的測定

1、實驗二 蛋白質(zhì)分子量的測定凝膠層析法一、原理凝膠層析法是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，又叫分子篩層析法，排阻層析法。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同的進行分離，如同過篩可以把大顆粒與小顆粒分開來一樣。但是這種“過篩”與普通過篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸，使充分洗液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部而言凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，而使樣品分子不同的分子得到分離。凝膠室又叫退溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然還是人工合成凝膠，他們的內(nèi)部都具有很

2、多和微細的多孔網(wǎng)狀機構(gòu)，凝膠層析法常用天然凝膠是瓊脂凝膠，人工合成的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠，和葡萄糖凝膠，具有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水。這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，起孔隙代銷與被分離物質(zhì)分子的大小有相似的數(shù)量級，在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只能有相應(yīng)的小分子可以通過，適用于分離小物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適用于分離大分子的物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。以下進一步來說明凝膠層析的原理。將凝膠裝在柱子里，柱床體積稱為總體積，以Vt表示。實質(zhì)上Vt是由Vo、Vi與Vg三部分組成，既Vt=Vi+Vg+Vo。Vo稱為孔隙體積或者外體積，又稱為外水體積，即存在于柱床內(nèi)

3、凝膠克里外面孔隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)部流動相的體積；Vi為內(nèi)部體積，濟寧叫顆粒內(nèi)部所含水相的體積，因此Vt-Vo=Vi+Vg脫洗體積與Vo及Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式子中的Ve為脫水體積，自加入樣品時算起，到祖墳最大濃度出現(xiàn)時候流出的體積，Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，與柱的長短粗細無關(guān)，也就是說他對每一個物質(zhì)為常數(shù)。與柱的物理條件無關(guān)。Kd可以通過實驗室求得。上式子可改寫成： Kd=（Ve-Vo)/Vi，Vo表示外體積；Vi內(nèi)體積；VeII、VeIII分別代表組分II和III的洗脫體積。Kd

4、可以有下列幾種情況：1、當Kd=0時，則Ve=Vo。即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)（全排阻），洗脫體積等于空隙體積2、當Kd=1時，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)體積之和 ?？梢钥闯?，對某一凝膠介質(zhì)，兩種全排出的分子即Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣兩種分子如都能進入內(nèi)部空隙，即Kd都等于1，它們即使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。3、當0<Kd<1時，Ve=Vo+KdVi。表示內(nèi)體積只有一部分可被組分利用，擴散滲入，Vo即在Vo與Vo+Vi之間變化。4、有時Kd&

5、gt;1時，表示凝膠對組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠超出理論計算的最大值，這些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，絡(luò)氨酸和色氨酸在Sephadx G-25中德Kd值分別為1.2，1.4和2.2。在實際工作中，對小分子物質(zhì)也得不到Kd=1的數(shù)值，特別是交聯(lián)度大的凝膠差別更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。這是由于一部分水相與凝膠結(jié)合較牢固，成為凝膠本身的一部分，因而不起作用，小分子不能擴散入內(nèi)所致。此時Vi即不能以g·WR計算，為此也常有直接用小分子物質(zhì)D2O，NaCl等通過凝膠柱而由實驗計算出Vi值的。另一

6、個解決的辦法是不使用Vi與Kd，而用Kav（有效分配系數(shù)）代替Kd，其定義如下：已知 Kd= Ve-VoVi， Vt-Vo代替Vi，則：Kav=Ve-Vo/Vt-Vo 即 Va=Vo+Kav(Vt-Vo)在這里實際上將原來以水作為固定相（Vi）改為水與凝膠顆粒Vt-Vo作為固定相，而洗脫劑（Ve-Vo）作為流動相。Kav與Kd對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當流動相流動Vt體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，只一點為凝膠層析法的特點，與一般層析方法不同。Ve與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過凝膠柱是，按

7、分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示： Ve=K1-K2logM K1與K2為常數(shù)，M為分子數(shù)，Ve也可用Ve-Vo（分離體積）,Ve/Vo相對保留體積，Ve/Vt（簡化的洗脫體積,它受柱的填充情況的影響較?。┗騅av代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。通常多以Kav對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”。曲線的斜率是說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線越陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定與溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的的分子量，測定時以便用曲

8、線的直線部分為宜。用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量，方法簡單，技術(shù)易掌握，樣品用量少，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可。例如在一粗酶制劑中，為了測定某一酶組分的分子量，只要測定脫洗液中具有該酶最大活性的部分，然后確定其洗脫體積，即可從標準曲線中查出其分子量。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等會與葡聚糖膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶底物絡(luò)合物相似，因此在葡聚糖凝膠上層析時表現(xiàn)異常，用凝膠層析法所測分子量的結(jié)果，要和其他方法的

9、測定相對照，由此才可作出可靠的結(jié)論。凝膠層析技術(shù)操作方便，設(shè)備簡單，周期短，重復(fù)性能好，而且條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，目前以得到相當廣泛的應(yīng)用，例如可用于脫鹽，濃縮高分子物質(zhì)的分子量。下面實驗是利用葡聚糖凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量。二、試劑和器材【試劑】1、標準蛋白質(zhì)：藍色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC(13.7KD)等，均為分析純。2、洗脫液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5M KCl 20ml，0.2M Tris 25ml，0.1M HCl 40.3ml，再加H2O定容至100ml3、Se

10、phadex G-75（或G-100）。【器材】1、層析柱：柱管1.2×50cm。2、核酸蛋白檢測儀（或紫外分光光度計）。3、部分收集器。4、刻度試管。三、操作方法與結(jié)果（一）凝膠柱的準備1、凝膠的選擇和處理1凝膠的選擇：凝膠型號很多。型號不同，篩分范圍亦不同。市售的Sephadex的分離范圍，常用高聚糖或球蛋白測定。Sephadex G型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。如果用于分離核糖時，則限于其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團的影響，選用高于它們分子量范圍的型號，或者選用適當型號的生物膠和Sephacryl。在去除蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時，可選用凝膠Sephadex G-25.當溶液通過G-25柱時，蛋白質(zhì)

11、被排阻在凝膠外面先流出來，而鹽類則擴散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來，這樣就使蛋白質(zhì)得到純化。一般說來，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間量差別越大，分離效果越好。2凝膠的處理：葡聚糖凝膠是以干粉保存的，因此使用前必須將干凝膠浸泡于將要做洗脫劑的相同液體中，充分溶脹，然后才能使用。根據(jù)層析柱的體積和所選用的凝膠，膨脹后床體積，計算所需凝膠干粉的重量，將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，一般為水、鹽溶或緩沖液，放置在室溫，使之充分吸水溶脹。注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。浸泡時間根據(jù)凝膠交聯(lián)度不同而異。為了縮短溶脹時間，可以在沸水浴上加熱至將近100，這樣可大大縮短溶脹時間至幾小時，而且還可殺死細菌和霉菌和排除凝

12、膠內(nèi)部包藏著的氣泡。但是，必須避免置于酸或堿溶液中加熱。凝膠顆粒最好大小比較均勻，這樣流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。如果顆粒大小不勻，可以在浸泡時用傾瀉法將不易沉下的較細的顆粒傾去。裝柱前最好將處理好的凝膠置真空干燥器中抽真空，以除盡凝膠中的空氣。2、凝膠柱的制備1柱的選擇：層析柱是所有層析方法的主要組成部分。因此，對層析柱（包括體積和長度等）選擇的合理與否，將直接影響分離效果。當用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，長層析柱比短的分辨率高；當用同樣長度的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時，層析柱直徑大的比小的分辨率高；當用同樣體積的層析柱分離兩種以上物質(zhì)時，仍時層析柱長的比短的分辨率高。一般理想的層析柱之直

13、徑和長度之比是1：25100。層析柱最好有架套，這樣溫度可以控制，得到的結(jié)果可以重復(fù)。2裝柱：層析柱必須粗細均勻，柱管大小可根據(jù)實際需要選擇。一般柱直徑（半徑）為1cm，如果樣品樣比較多，最好用直徑2-3cm柱。但若直徑太小時會發(fā)生“壁管效應(yīng)”，即在柱管中心部分組分移動較慢，而在管壁周圍移動較快，因而影響分離效果。一般說來，柱越長，分離效果愈好，但柱過長，實驗時間長，而且樣品稀釋度大，易擴散，分離效果反而不好。一般來說，用于脫鹽時，柱高50cm比較合適；在進行分級分離時，100cm高就已足夠。 裝柱方法與一般柱層析法相似，柱管可用一般柱層析管，柱的下端縮口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底

14、下用棉花或玻璃纖維填棄。如用燒結(jié)玻璃砂板做底，盡管用細孔的（3號），粗孔的則要在其上鋪一層濾紙或尼龍濾布。先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的凝膠攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱內(nèi)，待其自然沉降至柱高的1/41/3時，打開柱下端出口，讓溶劑慢慢流入，使柱上端懸浮液面緩慢下降至需要的高度。要注意顆粒間沒有夾雜氣泡，最好不用分次填裝法或稀的凝膠懸浮液裝柱。凝膠沉集后，將溶劑放出，再通過2-3倍柱床體積的溶劑使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防在加樣時凝膠被沖起來。要注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干，分離效果變壞，并有可能混有氣泡，

15、影響液體在柱內(nèi)的流動。3、加樣：加樣量與測定方法和層析柱大小有關(guān)。測定樣品含量的方法靈敏或床柱體積小時，加樣量可少。否則反之。例如，一般測定蛋白質(zhì)的含量多用紫外分光光度法。當采用280nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量需5mg左右（柱體積2×60cm）；當采用220nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量只需要1.2mg左右。加樣量掌握得當，可提高分離效果。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越?。悠窛舛雀撸直媛试礁?。但用于樣品的制備和脫鹽時，加樣量應(yīng)在不影響分辨率的前提下增大。此外，樣品的粘度也影響層析的分辨率，樣品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的樣品粘度應(yīng)小于2，或者與洗脫液的粘度相當為宜。加

16、樣的方法與一般柱層析法相同，將柱中多余的液體放出后，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開管夾，使樣品溶液流入柱內(nèi)。然后加入溶劑或鹽溶液洗脫。4、洗脫：所有洗脫液均以能溶解洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。洗脫用的液體應(yīng)與浸泡膨脹凝膠所用的液體相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積發(fā)生變化而影響分離效果。洗脫所用的液體有水（多用于分離不帶電荷的中性物質(zhì)）及電解質(zhì)溶液（用于分離帶電基團的樣品），如酸、堿、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強的組分，也有使用水與有機溶劑的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作為洗脫劑，可以減低吸附，將組分分洗下。洗脫時的流速要嚴格控制。否則收集的每一部分洗脫體積就不會

17、恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進行。事實上，大多數(shù)實驗室是采用后一種方法進行控制流速的。流速在洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關(guān)。凝膠層析與一般離子交換樹脂不同，加壓超過一個極限值，不僅不能增加速度，反而使流速急劇下降。流速對交聯(lián)度不同的凝膠是不同的。對交聯(lián)度大的凝膠（G-10至G-50型），流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關(guān)。對交聯(lián)度小的凝膠（G-75至G-200型），流速與柱的直徑有關(guān)，并在一定的適宜操作壓差下有最大的流速。流速亦受顆粒大小影響，顆粒大

18、時流速較大，但流速大時洗脫峰形狀較寬，顆粒小時流速較慢，分離情況較好。在操作時應(yīng)根據(jù)實際需要，在不影響分離效果的情況下，盡可能使流速不致太慢，以免時間過長。5、柱的重新填裝：由于在洗脫過程中，所有組分一般可全部自柱上洗下，所以裝好一次柱管之后，可以反復(fù)使用，無須特殊的“再生”處理。但由于在使用過程中，顆?？赡軡u漸沉積壓緊，因此在使用一段時間后，流速可能漸漸減低，使一次分析時間拖長很久，這時需要將凝膠倒出，重新填裝，或者用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行降沉。有時流速改變是由于柱頂上有灰塵集聚，則需將表面層除去。由于葡萄糖凝膠為糖類化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止發(fā)霉與生長細菌。

19、一般可用0.02%的疊氮鈉（NaN3）溶液，它極易溶于水，不與蛋白質(zhì)和糖反應(yīng)，也不改變他們的層析效果。也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%（0.01-0.02%）三氯丁醇溶液，但它在強堿性溶液或加熱到60度以上時就要分解。在弱堿性溶液中也有用0.01%乙醇爾溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑，因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果。6、凝膠的保存方法：凝膠用完后可用以下方法保存：（1）、膨脹狀態(tài)：即在水相中保存，可加入上述防腐劑，或加熱滅菌后于低溫保存。（2）、半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈，然后再用60-70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫保存。（3）、干燥狀態(tài)：用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽慮至干，于60-8