HIV 檢 測 技 術

1、艾滋病檢測技術艾滋病檢測技術 嘉興市疾控中心 葛志堅 檢測的重要性n任何錯誤的診斷，包括假陽性或假陰性，都會對被檢者甚至對家庭和社會都產生十分重要的影響 n艾滋病診斷的一項重要指標，也是控制HIV傳播和控制艾滋病流行的重要手段 檢測的目的檢測的目的 n診斷診斷 為確定個體HIV感染狀況，包括臨床檢測和自愿咨詢檢測、術前檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等。n監(jiān)測監(jiān)測 為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢，檢測的人群包括各類高危人群和一般人群n血液篩查血液篩查 為防止輸血傳播HIV而進行的檢測，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。n臨床治療和預后的判斷臨床治療和預后的判斷 療效觀察和耐藥性監(jiān)測 HIVHI

2、V感染的實驗室檢測感染的實驗室檢測n常用常用HIVHIV病原學檢測方法病原學檢測方法: :n 病毒分離病毒分離n 抗原檢測抗原檢測n 核酸檢測（核酸檢測（ HIV核酸定性檢測、HIV- RNA定量測定）n常用常用HIV抗體檢測方法（均未能檢測抗體檢測方法（均未能檢測N型）型）n 篩查實驗方法篩查實驗方法 ELISA，膠體金（硒），膠體金（硒）， PA 法，法，斑點斑點EIA ，唾液、尿液檢測唾液、尿液檢測卡卡 ，化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析 確認實驗方法確認實驗方法 免疫印跡法，條帶免疫法，免疫印跡法，條帶免疫法， 放免法放免法,間接免疫熒光試驗n其他其他 CD4+/CD8+ T cell

3、 計數(shù)等計數(shù)等病毒感染后病毒RNA和血清標記水平1020304050607080900病毒病毒RNA,抗原或抗體水平抗原或抗體水平HIV-1RNAAb to HIV-1p24 AgHIV HIV 抗抗 體體 檢檢 測測 方方 法法 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISAELISA）最早出現(xiàn)、發(fā)展最快、至今仍普遍使用最早出現(xiàn)、發(fā)展最快、至今仍普遍使用 很高的靈敏度和特異性很高的靈敏度和特異性 適合對大量樣品的檢測適合對大量樣品的檢測 可以進行很方便的質控工作，因此是目前臨床最常用的篩查可以進行很方便的質控工作，因此是目前臨床最常用的篩查檢測方法檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗（E

4、LISAELISA） 目前主要使用第三代抗HIV抗體1/2試劑（即雙抗原夾心法） 第四代ELISA試劑可同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試劑相比，檢出時間提前了49d。HIV ELISAHIV ELISA試劑的發(fā)展過程試劑的發(fā)展過程第四代ELISA試劑n優(yōu)點：縮短了窗口期n缺點：同時把抗原和抗體包被在反應板上，存在互相干擾的可能，檢測的敏感性和特異性可能都會受到影響。第四代試劑檢測p24抗原的敏感度(20100pg/m1)，單獨檢測p24抗原試劑的敏感度 (3.510pg/m1)。HIV感染窗口期1st-2nd 代代3rd 代代=Detection limit

5、2%。另外，文獻報道大約4%20%的樣品經過HIV初篩復檢陽性后，WB結果為“不確定”。nWB不確定結果的出現(xiàn)確實給臨床診斷帶來困難，需要更多的時間和實驗進一步確認，也會對受試者造成額外的心理負擔。從另一方面而言，WB不確定結果確是受試者真實的血清學反應。HIV抗體不確定n對于符合HIV抗體不確定判斷標準，報告“HIV抗體不確定（）”，在備注中應注明“3個月后復檢”，同時進行以下處理：n(1) 隨訪復檢：每3個月隨訪復檢1次，連續(xù)2次，共6個月。如果檢測時暴露時間已超過3個月，則在3個月后隨訪1次即可。將前后2份樣品同時檢測，仍呈不確定或陰性則報告HIV抗體陰性，如果在隨訪期間發(fā)生帶型進展，符

6、合HIV抗體陽性判定標準則報告HIV-1或HIV-2抗體陽性。n(2) 必要時可做HIV-1 P24抗原或HIV核酸測定，但檢測結果只能作為輔助診斷依據(jù)，確認報告要依據(jù)血清學隨訪結果。HIV抗體不確定n當出現(xiàn)任何HIV病毒特異條帶，但不足以被判斷為陽性則判定為不確定結果。不僅初篩陽性的標本可以出現(xiàn)不確定的結果，初篩陰性的標本經WB檢測也有大約15%出現(xiàn)針對一個或幾個抗原的不確定結果。WB不確定結果中p24條帶最常出現(xiàn)（60%91.6%），gp120/gp160出現(xiàn)的頻率其次。WB不確定結果出現(xiàn)原因比較復雜，與檢測對象、檢測試劑和實驗操作有關，詳見下表。WB不確定出現(xiàn)的原因不確定出現(xiàn)的原因 nH

7、IV及相關感染 ：早期血清學轉換 、AIDS晚期 、早產感染 、HIV缺失株感染 、免疫靜止型AIDS 、HIV-2感染 、散發(fā) HIV/SIV(猴免疫缺陷病毒) 。n其它逆轉錄病毒感染 ：山羊關節(jié)炎-腦炎病毒n其它臨床狀態(tài) ：自身免疫疾病（系統(tǒng)性紅斑狼瘡，原發(fā)性干燥綜合征）、麻風病、惡性腫瘤、高膽紅素、高核蛋白、高類風濕因子n無感染 ：HIV陽性母親所生的正常嬰兒、未篩查血液制品的接受者、疫苗試驗志愿者、保持WB結果不變的供者WB不確定出現(xiàn)的原因不確定出現(xiàn)的原因n檢測試劑 ：宿主細胞蛋白殘留、判斷準則、試劑盒的條件優(yōu)化/穩(wěn)定性n實驗操作 ：交叉污染、試驗程序、儀器設備、樣本處理及溶血其它確認

8、試驗其它確認試驗線性免疫試驗：線性免疫試驗：將HIV的重組和合成多肽抗原包被在硝酸纖維素膜條上，用于檢測樣本中的HIV-1和（或）HIV-2抗體。該法可降低來自細胞培養(yǎng)的雜質蛋白污染而引起非特異反應，在歐洲應用廣泛，大量研究報道稱它的準確性與免疫印跡法相當。其它確認試驗其它確認試驗n放射免疫沉淀試驗：n用同位素標記的HIV蛋白與待檢血清反應，若血清中含有HIV抗體即可與HIV蛋白抗原結合，再加入葡萄球菌蛋白A，經低速離心，然后將沉淀復合物分離后電泳，放射自顯影觀察同位素標記蛋白帶即可判定。本法靈敏度和特異度均好，但因試劑制備復雜，成本高，且同位素操作需要嚴格防護而限制其應用。其它確認試驗其它確

9、認試驗n間接免疫熒光試驗：n將HIV感染的細胞作為抗原固定在玻片上，再在其上滴加待檢血清，若含有HIV 抗體，則與細胞膜上的病毒抗原結合，清洗后加熒光標記的抗人IgG，洗去未結合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察結果，胞漿內出現(xiàn)特異性熒光，而對照孔沒有特異性熒光，就可診斷為HIV抗體陽性。此法操作簡便，敏感性及特異性均較ELISA法高，但存在對某些血清非特異性熒光難以去除，結果判斷需要熒光顯微鏡，需要受過良好訓練的技術人員，對結果的觀察和解釋易受主觀因素的影響，結果也不宜長期保存。HIV抗原的檢測抗原的檢測 n窗口期 ：HIV 感染人體后有一段窗口期，在這段時期病毒抗體不能被檢出，但可以檢測到病毒

10、相關抗原或分離病毒。HIV-1感染機體后, 感染者血液中最早出現(xiàn)的是病毒gag基因表達產物p24抗原, 然后才出現(xiàn)相應的特異性抗HIV抗體, 以后隨抗體滴度的升高p24抗原含量呈逐漸下降的趨勢以至檢測不出。在病情發(fā)展到AIDS期，病毒大量復制，機體免疫力下降，所產生的抗體不足以中和病毒抗原時，p24抗原在血中又可檢測出。 HIV抗原的檢測抗原的檢測n陽性母親所生育嬰兒檢測：HIV陽性母親所生育的嬰兒30%可能已受到感染，但由于嬰兒體內母源性抗HIV抗體可持續(xù)18個月之久，常規(guī)檢測抗HIV抗體須要在嬰兒18個月以后才能確定嬰兒體內的HIV抗體是來自母體，還是自身產生，而HIV抗原的檢測則可彌補這

11、一不足。 HIV抗原的檢測抗原的檢測nHIV-1抗體不確定n第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應，但HIV-1抗體確認陰性者的輔助診斷。n監(jiān)測病程進展和抗病毒治療效果n針對HIV抗體產生前的血液產品進行篩查 n對HIV病毒暴露但血清學陰性的個人進行早期感染的檢測 HIV抗原的檢測抗原的檢測n聯(lián)免疫分析（ELISA）n放射免疫分析（RIA）n免疫熒光技術（IFA）n免疫吸附電鏡法（Immunosorbent Electron Microscopical method，ISEM） ELISA檢測P24抗原技術 n檢測HIV感染敏感的常規(guī)方法 n雙夾心抗體法（原理同雙夾心抗原法）n

12、假陽性高需用中和試驗加以鑒別 ELISA檢測P24抗原改進技術n超敏感酶免疫測定法(Ultrasensitive enzyme immunoassay，UEI)又稱雙位點免疫復合物轉移酶免疫測定，基本技術路線是利用高親和力抗體濃縮富集血清中的P24抗原，然后進檢測。該法可將下限延伸至0.2pgmln線性免疫酶測定(1ineal immunoenzymatic assy，LIA)和Cobas Core HIVCombi EIA是新近發(fā)展起來的第四代HIV檢測技術。目前最敏感的抗原試劑盒的檢測閥值為0.01pgml。 HIV抗原檢測局限性 p24蛋白只是個臨時標志，急性感染期之后就很快降低到無法檢

13、測的水平，只有在病人的AIDS階段才重新出現(xiàn) HIV-1 P24 抗原的陽性結果必須經過中和試驗確認，該結果僅作為 HIV 感染的輔助診斷依據(jù)，不能據(jù)此確診 HIV-1 P24 抗原檢測陰性只表示在本試驗中無反應，不能排除HIV感染 HIV核酸測定HIV核酸定性檢測：是否存在病毒核酸HIV核酸定量檢測：血液中病毒復制水平HIV核酸定性檢測 血漿、血清或全血中 HIV-1 RNA & DNA PCR & RT-PCR 方法HIV PCR檢測的主要用途嬰兒HIV感染的診斷 檢測HIV前病毒 DNA是嬰兒HIV感染診斷首選的方法，與病毒培養(yǎng)和隨訪的符合率達到95-100%。HIV感染

14、的早期診斷 感染以后1-2周就可用PCR方法檢測出HIV 基因，比抗體出現(xiàn)的時間提前，使窗口期大大縮短，有利于早期診斷。HIV抗體檢測不確定結果的診斷 有助于及時闡明HIV抗體的不確定結果是早期HIV感染還是非特異性反應，在迫切需要診斷結果的時候很有用處。 HIV DNA PCR實驗是嬰兒HIV感染診斷首選的方法 HIV DNA PCR方法是在新生兒期診斷HIV感染的一種敏感的方法 38感染的孩子在出生后48小時HIV DNA PCR就可呈現(xiàn)陽性 在出生后第二周，檢測的敏感性大幅度上升，14天時陽性率達到93 28天時陽性率是96，并且具有很高的特異性（大約99） 一次檢測呈陽性提示可能存在H

15、IV感染，應采集第二份標本重復病毒學實驗以便進行確認。兩次不同時間采集的標本HIV病毒學實驗均為陽性即可得出HIV陽性的診斷 對HIV陽性母親所生新生兒的檢測程序是： 出生后48小時進行第一次檢測，大約38感染的嬰兒可以在這個時期得出診斷 出生時檢測為陰性的嬰兒應在14天進行一次重復檢測，因為病毒學實驗檢測的敏感性在2周時大幅度增加了 仍然陰性的嬰兒應該在12個月時進行重復檢測 出生時和12個月時病毒學檢測為陰性的孩子應該在36個月時再次進行檢測 HIV核酸定量測定n輔助診斷:n在一般情況下，HIV抗體檢測足以對HIV感染與否做出正確診斷，但在特殊情況下，單純抗體檢測不足以完成明確的判定，如出

16、現(xiàn)某些非典型的抗體反應形式，特別是不確定反應時，RNA的測定可提供非常有用的證據(jù)。雖然單純使用RNA測定不能完全確定感染與否，但當RNA測定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽性結果時（3，000c/ml），感染發(fā)生的可能性非常大。n每一種RNA定量系統(tǒng)都有其最低檢測限，即可以測出的最低拷貝數(shù)，通常在50100c/ml以上，RNA定量檢測時未測出不等于樣品中不含有病毒RNA。另外，許多AIDS病人/HIV感染者在接受抗病毒治療后其病毒載量可降至非常低的水平，還有少數(shù)HIV感染者在感染后長期處于病毒水平非常低的狀態(tài)，進行RNA測定時往往測不出來。因此，使用此指標應綜合其它檢測數(shù)據(jù)和樣品背景情況進行綜合判斷。HIV

17、核酸定量測定n早期診斷n在HIV感染的窗口期無法使用抗體檢測進行診斷。而在感染早期，在抗原峰出現(xiàn)前后通常出現(xiàn)一個病毒載量的高峰，此高峰通常高于發(fā)病時的血漿病毒水平，并且有證據(jù)表明這個時期的病毒具有很高的感染能力。這個高峰在免疫系統(tǒng)產生反應后，尤其是在細胞免疫出現(xiàn)后開始下降。因此早期病毒RNA測定具有特殊的意義。該方法也可用于HIV感染孕婦所生嬰兒的早期輔助診斷。n目前國際上正在嘗試使用這種檢測對采供血樣品進行多個樣品混合后的RNA檢測以減少窗口期危險（降低“殘余危險度”）。HIV核酸定量測定n病程監(jiān)控n根據(jù)HIV感染發(fā)生后病毒載量具有一定的變化規(guī)律，并且這種變化與疾病的進程有著密切的相關性。因

18、此定期進行病毒載量的檢測有助于確定疾病發(fā)展的階段，以確定相應的治療方案。n通常在HIV感染后無癥狀期內發(fā)生的感染或其它臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時的癥狀區(qū)別，為確定一個剛發(fā)生的癥狀是否與HIV的感染有關，醫(yī)生往往需要觀察病人的實驗室指標，病毒載量就是一個非常重要的指標。HIV核酸定量測定n指導治療方案及療效判定n臨床實踐證明，并非在任何情況下HIV感染者都應該進行抗病毒治療。這不單是經濟上的原因，更重要的是由于抗病毒藥物的副作用和療效原因。通常在病毒載量達到一定水平后（如35，00050，000c/ml）抗病毒治療才具有良好的效果。在進行治療后，通過病毒水平的檢測才能確定治療是否有效，通常在治

19、療前后病毒水平降低0.5 log以上才被認為臨床有效。HIV核酸定量測定n預測疾病進程nHIV感染后疾病進程與病毒載量的關系十分密切，觀察HIV感染者病毒RNA水平可大致預測其發(fā)病的可能。病毒載量與6年發(fā)病率的關系為：30，000c/ml時則為80%。當HIV感染者CD4+T細胞計數(shù)200/l時，病毒載量與36個月發(fā)展至AIDS的危險為：10，000c/ml為4.9%;10，00029，999c/ml為12.7%;30，00099，990c/ml為17.7%;100，000c/ml為22.4%。在CD4+ 細胞數(shù)相同的情況下，年紀大的比年輕患者發(fā)展至AIDS的危險更大（AIDS 2004；18

20、：51-58.）。HIV核酸定量測定 常用的常用的HIV RNAHIV RNA定量測定方法定量測定方法 核酸序列擴增試驗（NASBA） 逆轉錄PCR試驗（RT-PCR） 分支DNA雜交試驗（bDNA） 熒光定量PCR試驗核酸測定注意事項n標本類型 n血漿和血清標本都可用來測定病毒載量，用三種測定方法進行比較都發(fā)現(xiàn)血清和血漿測定的結果有高度相關性。但是血清的檢測結果大約是血漿的50%（30-80%），可能是因為血液凝固的過程中HIV顆粒被包裹在纖維蛋白網(wǎng)絡中，導致血清中病毒的濃度下降。因此，測定病毒載量應該首選血漿標本，血漿也是臨床使用的唯一標本。血清標本對于研究也是可以接受的，重要的是每位病人

21、使用的標本類型應始終保持一致。 核酸測定注意事項n抗凝劑 n抗凝劑能夠顯著影響測定的結果。肝素鈉處理的血漿不適合做Amplicor HIV-1 Monitor試驗，因為肝素是PCR反應的一個潛在的抑制劑。如果必須用RT-PCR方法測量肝素處理的血漿，可以向標本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素處理的血漿中病毒顆粒降解的速率顯著高于EDTA鈉鹽和枸櫞酸鈉處理的血漿，一般情況下不同抗凝劑處理的血液6小時之內HIV RNA的降解速率分別是1.8%/小時（EDTA）、3.3%/小時（枸櫞酸鈉）和5.0%/小時（肝素）。在血液處理方法相同的條件下，用EDTA鈉鹽抗凝的血漿結果顯著優(yōu)于枸櫞酸鈉和肝素，因此

22、EDTA鈉鹽是首選的抗凝劑。 核酸測定注意事項n標本處理時間和溫度 nHIV-1在體內進行快速轉換，平均半衰期是大約6個小時。HIV-1在體外未處理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA的降解速率在6小時之內平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小時，采血以后30小時內可能減少0.5log。因此為了減少病毒顆粒降解對檢測的影響，應該在采血以后6小時之內分離血球和血漿，如果做不到就應該使用血漿分離管，立即離心4存放，需要保存30小時以上就應該放在-70。 n溫度對HIV RNA的影響不顯著。-70室溫反復凍融3次，HIV RNA變化的幅度小于0.2log。-70保存5個

23、月，HIV RNA減少0.3-0.5log，-70保存12個月，HIV RNA減少一般不超過0.4log。血漿在室溫或4 保存3天，HIV RNA減少不超過0.5log。 CD4細胞檢測細胞檢測CD4+T淋巴細胞計數(shù)測定的主要意義 用于HIV感染者的疾病分期： CD4+T淋巴細胞0/mm3 艾滋病期判斷HIV感染者的臨床合并癥 各種機會性感染與CD4+T淋巴細胞的相關性。 幫助確定抗HIV藥物治療及機會性感染預防性治療 的適應癥 抗HIV藥物療效的重要判斷指標。（周后上升）與艾滋病相關的免疫細胞檢測與艾滋病相關的免疫細胞檢測n艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，主要表現(xiàn)為患者免疫功能低下。對HIV

24、感染者與艾滋病患者進行免疫學功能檢測感染者免疫狀況，有助于預測判斷疾病進程、評價抗病毒藥物治療效果和估測預后。與艾滋病相關的免疫細胞檢測指標主要CD4+ T淋巴細胞數(shù)目、CD8+ T淋巴細胞數(shù)目以及CD4+/CD8+的比例，更為精細的指標還包括NK細胞、B淋巴細胞、HIV特異性T細胞等。其中最重要的指標為CD4+ T淋巴細胞數(shù)目。nAIDS是由HIV引起的一組綜合征，HIV主要侵犯人CD4+ T淋巴細胞，導致其數(shù)量上的減少和功能缺陷，使機體免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最終導致各種機會感染和腫瘤。因而，對HIV感染者和AIDS病人定期進行CD4+、CD8+T淋巴細胞 檢測具有十分重要的意義。

25、 CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測意義 n了解機體的免疫狀態(tài)以進行疾病分期，以如美國CDC就是以此為基礎制訂了HIV感染者/AIDS病人的診斷和分類標準（見表1），目前國內外仍被采納應用。我國國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊中將CD4+T淋巴細胞CD4350/ l作為開始抗病毒治療的標準。CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測意義n長期監(jiān)測CD4+ T淋巴細胞絕對數(shù)的變化，有助于了解患者的病情發(fā)展，決定正確的治療方案，并觀察對治療的反應。如判斷HIV感染者的臨床合并癥（如當CD4+ T淋巴細胞細胞200/l時，很容易發(fā)生卡氏肺孢子蟲肺炎）。CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測意義n幫助確定抗HIV藥物治

26、療及預防機會性感染治療的適應癥，如當CD4+ T淋巴細胞200/l時，應給予抗卡氏肺孢子蟲肺炎的預防性治療。CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測意義n是用來評價一些新的、針對HIV的治療方法和治療藥物療效的重要指標。（周后上升）CD4檢測注意事項n抗凝管 ：K3EDTA n采血時間：某個相同的時段。如：每次采樣時間均在上午或均在下午。n溫度：18-25保存和運輸樣品n運送時間：樣品應在48小時之內送達檢測實驗室 HIVHIV診斷試劑臨床質量評估方案診斷試劑臨床質量評估方案評估目的評估目的 對國內市場銷售的國產和進口的HIV診斷試劑的敏感性、特異性、批間差異和適用性進行綜合質量評估，及時發(fā)現(xiàn)和解決試劑質量問題； 為中央和地方衛(wèi)生行政部門提供有關的決策依據(jù)，并作為艾滋病實驗室選擇試劑的依據(jù)。 評估組織形式評估組織形式 國家級評估國家級評估 國家艾滋病參比實驗室（簡稱參比實驗室）負責組織全國的HIV診斷試劑臨床質量評估，選擇部分具備資質的艾滋病確認中心實驗室和確認實驗室參與評估。每年至少組織1次。評估組織形式評估組織形式 省級評估省級評估 省艾滋病確認中心實驗室為各省HIV診斷試劑臨床評估的主要職能單位。由省艾滋病確認中心實驗室組織評估本省使用的HIV診斷試劑質量，選擇省內艾滋病確認實驗室或具備資質的艾滋病篩查中心實驗室參與評估，每年至