液相色譜峰形問題 減少拖尾

1、液相色譜峰形問題 減少拖尾  2010-09-17 06:46:08|  分類： 03液相色譜問答 |  標簽：液色迷人  液相色譜專家  四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀  液相色譜品牌排名  |字號 訂閱 液相色譜峰形問題減少拖尾 液相色譜峰形拖尾解決方案液相色譜峰形問題 - 夜色磚家的日志 - 網(wǎng)易博客高效液相色譜法專家專注hplc藥物分析 液相.在流動相中加入三乙胺，能顯著的改善.四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四

2、.3）增加流動相中緩沖鹽的濃度 增加緩沖 2010-12-26 - 百度快照三、峰形問題    峰形對稱性的優(yōu)劣對峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準確性。引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個特點：對先出的峰影響大，對后出峰影響??；柱頭塌陷、柱頭和篩板污染會引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會造成峰拖尾。色譜實踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對峰形有很大影響。1.  峰后拖常見的3種拖尾情況：次級保留引起峰拖尾的機

3、理解析：反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有COOH、NH2、NHR、NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級保留效應(yīng)。    反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.54.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動相的pHpKa>2即pH>6.7時，99以上的硅羥基應(yīng)該是呈離子狀態(tài)的，即SiO ，而pKapH>2即pH<2.5時，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99以上的硅羥基應(yīng)該是呈分子狀態(tài)的，即SiOH，但其極性仍然存在，即SiOH。SiOH和SiO對于極性化合物之間

4、的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強得多。同時，因為硅膠表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。    上圖是填料表面的示意圖，完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8?mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應(yīng)的僅達23.5?mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應(yīng)，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個惰性基團。三甲基硅烷還是比氫原

5、子大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。    相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機會，獲得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XBC18、AQC18和Xtimate C18采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰尾工藝。解決方案：1）先檢查樣品是否過載，由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進樣量（包括進樣體積或濃度），進樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測定：2）調(diào)節(jié)流動相pH將流動相的pH調(diào)至比弱酸pKa小2以上，比弱

6、堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定：    堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH< 8.64的時候它是完全呈離子態(tài)的， 那么pH在2.58.64時，特別是pH6.78.64時，此時甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)NH3和SiO形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導(dǎo)致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林（含N(CH3)2，堿性比NH2強）在pH 7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱之間的優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好

7、。而在pH<2.5的條件下，也仍然后拖，是因為NH3足夠強，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與SiOH中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。當pH>12.64，大于pKa2以上時，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會引起拖尾。3）增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度：    流動相中加入緩沖鹽，增強了流動相的離子強度，在NH3等極性基團和硅羥基SiO之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機會，有助于削弱極性基團與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強吸電子基相連），或堿性很強，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被C18長鏈和封

8、尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測定：4）加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等    拖尾的產(chǎn)生是因為NH2、NHR、NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應(yīng)該有兩種，一種是占據(jù)硅羥基這個作用位點，另一種是占據(jù)NH2、NHR、NR2這個作用位點。     在流動相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH<11.0929.09的條件下是以離子狀態(tài)NH(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.58.64 硅羥基呈SiO離子態(tài)的情況下，NH(CH2C

9、H3)3容易與SiO形成相對較強的靜電吸引力。    加入三乙胺改善峰形的時候，有兩點需要注意：1）三乙胺的堿性很強，加入三乙胺后流動相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對色譜柱造成損傷。pH的改變也會導(dǎo)致出峰時間的顯著變化，可能引起的其它問題，建議流動相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。通常即使pH回調(diào)過后，由于三乙胺成為了固定相的一部分，保留時間也有較大變化；2）三乙胺在210nm處有比較強的吸收，如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時需要謹慎使用。    四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了

10、類似NH(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N(CH2CH2CH2CH3)4 ，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與SiO產(chǎn)生較強的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個不同于三乙胺的顯著特點是，它在低波長范圍的吸收比三乙胺弱。    流動相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑也能很好的改善峰形，其作用機理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同，是通過與樣品分子的作用來阻止樣品分子與硅羥基的作用來改善峰形。2峰前延峰前延發(fā)生的概率比較小，下面是三種前拖峰的表現(xiàn)形式：    造成前延峰的原因有多種，我們可依次逐一排查：1）樣品是否過載    降低進

11、樣濃度，看峰形是否有所改善。一般認為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。2) 檢查是否是用流動相溶解樣品    溶解樣品的溶劑（如純甲醇）洗脫能力比流動相強會發(fā)生峰前延。具體機理是：    正常的峰形應(yīng)該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個通過色譜柱柱床的過程中任何時候都呈正態(tài)分布。樣品溶液進樣后到達色譜柱時間很短，應(yīng)還未被流動相充分稀釋，洗脫能力更強的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導(dǎo)致峰前延。3）增加流動相中緩沖鹽的濃度    增加緩沖鹽濃度可以增大流動相中的離子強度，減少因

12、靜電的作用（有可能存在于樣品分子之間、也有可能存在于樣品分子與填料表面之間）引起的前延。例如：注射用苦參堿的測定4）流動相中加入適量的四氫呋喃    往流動相中加入少量的四氫呋喃有時可以改善峰形、增大分離度，很多色譜工作者都知道和使用，但其機理似乎少人提及。通常所加入的量在5以內(nèi)即可，需要的時候可以加入更大的量。例子如下：阿莫西林膠囊的測定色譜柱：Ultimate AQC18，5um，4.6×250mm；                  

13、60;                             檢測波長：254nm；        溫度：室溫28度；                          

14、;流  速：1.0ml/min；       進樣量：20ul；5）升高柱溫    升溫有助于增加流動相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對試劑的時候，最好不要超過40度。3其它峰形問題裂峰：    柱頭污染和柱頭塌陷都會造成裂峰，最常見的原因是篩板上顆粒物堵塞樣品進入色譜柱不均一，只需反沖色譜柱將顆粒物除掉就可解決。液相色譜峰形問題 - 夜色磚家的日志 - 網(wǎng)易博客高效液相色譜法專家專注hplc藥物分析 液相.在流動相中加入三乙胺，能顯著的改善.四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四