大鼠整體低氧預(yù)處理減輕肺缺血再灌注損傷

1、大鼠整體低氧預(yù)處理減輕肺缺血再灌注損傷 作者：李濤，陳瑩，李保羅，陸德琴【摘要】 目的： 探討低氧預(yù)處理（HPC）對肺缺血再灌注 ( I/R) 損傷的保護(hù)作用。方法： 重復(fù)性低氧5次建立大鼠HPC模型，雙活結(jié)套扎左側(cè)肺門45 min后再灌注120 min復(fù)制肺I/R損傷模型；設(shè)立對照組、I/R組和HPC +I/R組，每組10只大鼠，檢測各組肺組織濕重與干重比，肺組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過氧化物酶(MPO)活性。結(jié)果： I/R組大鼠肺組織濕重與干重比較對照組明顯增加 (P<0.05) ，肺組織SOD活性顯著降低(P<0.01), MDA含

2、量和MPO活性明顯增高 (P<0.05)；HPC+I/R組大鼠上述指標(biāo)較I/R組均明顯改善，差異有顯著性。結(jié)論： 大鼠整體HPC可能通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肺的缺血再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】 缺血; 肺； 再灌注損傷; 低氧預(yù)處理; 大鼠，Sprague-DawleyAbstractObjective: To investigate the protective effect of hypoxic preconditioning (HPC) on lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: HPC model was es

3、tablished with 5 times of repetitive sublethal hypoxia. Thirty rats were randomly divided into the following three groups (n=10 in each): control group, ischemia-reperfusion injury group (group I/R), and group HPC+I/R. I/R injury model rats underwent 45 min of left hilar ligation followed by 120 min

4、 of reperfusion. The ratio of wet/dry weight of lung tissue was measured and calculated. The contents of malondialdehyde (MDA), and activities of superoxide dismutase (SOD) and myeloperoxidase (MPO) in lung tissue were determined with spectrophotometry. Results: In group I/R,the wet/dry weight ratio

5、 of lung was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the MDA content and MPO activity in lung tissue were dramatically higher (P<0.05), SOD activity was significantly lower (P<0.01) than those of control group. In group HPC+I/R, that rats subjected to HPC,

6、these oxidative stress indexes were significantly improved when rats exposed to ischemia-reperfusion.Conclusion: Whole-body hypoxic preconditioning in rats can protect lung from I/R injury by reducing oxidative stress.Key words ischemia; lungs; reperfusion injury; hypoxic preconditioning; rats，sprag

7、ue-dawley 缺血再灌注 (ischemia-reperfusion，I/R) 損傷現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來,已受到廣泛關(guān)注。低氧或缺血預(yù)處理(hypoxic/ischemic preconditioning，HPC/IPC)是目前認(rèn)為能有效地防治I/R損傷的手段之一。越來越多的研究表明，HPC/IPC產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象不僅存在于多種動物的心臟，而且存在于腦、肝和腎等多種器官和組織細(xì)胞，但其作用機(jī)制至今尚未完全闡明。臨床發(fā)現(xiàn)休克治療、心腦復(fù)蘇、肺栓塞治療后,肺都將經(jīng)歷I/R過程，且不可避免地受到不同程度的損傷。因此，肺I/R損傷及其所導(dǎo)致的肺功能障礙和防治也逐漸被人們重視。離體實(shí)驗(yàn)研究表明IPC

8、對肺I/R損傷有保護(hù)作用1,2，但也有研究認(rèn)為大鼠左肺門5 min的IPC并不能減輕肺I/R損傷3。本實(shí)驗(yàn)在整體動物水平上初步觀察大鼠經(jīng)HPC后對肺I/R損傷的保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 材料成年SD大鼠，體重180210 g，雌雄不拘，由貴州省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。主要儀器有：動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），低溫高速離心機(jī)（德國, Eppendorf），核酸蛋白分析儀（美國, Bio-Tek），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），754紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）

9、。1.2 方法1.2.1 低氧預(yù)處理（HPC）動物模型參考呂國蔚等4的方法，稍作改進(jìn)。將大鼠放入620 ml的廣口瓶內(nèi)，立即用橡皮塞密閉，當(dāng)大鼠出現(xiàn)喘呼吸時, 將大鼠取出并立即移入另一個相同容積的廣口瓶內(nèi)、密閉，如此反復(fù)操作5次，建立低氧預(yù)處理模型。1.2.2 肺I/R動物模型10水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉, 氣管插管, 接動物呼吸機(jī)。經(jīng)左前胸第5肋間開胸,游離左側(cè)肺門,用生理鹽水稀釋肝素50 U至500 l經(jīng)尾靜脈注入，5 min后于肺充盈末用手術(shù)絲線通過肺門雙活結(jié)套扎左側(cè)肺門，45 min后松開，再灌注120 min。對照組左肺門穿線但不結(jié)扎。1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 （1）對照組：開胸后

10、游離左肺門，穿線不結(jié)扎，不予其他處理；（2）肺I/R組：用手術(shù)絲線雙活結(jié)套扎左肺門，45 min后開放，再灌注120 min；（3）HPC+肺I/R組：經(jīng)HPC后的大鼠進(jìn)行肺I/R，方法同I/R組。1.2.4 標(biāo)本采集和處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取出左肺，切取中下段肺組織約0.2 g，置于新鮮配制的10中性福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，供HE染色；其余肺組織稱重后-70 凍存，以便分別進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測及計算肺濕重與干重比。1.2.5 肺組織濕重與干重比值取出已稱重的凍存的肺組織，放置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，80 連續(xù)烘烤24 h后取出，在電子天平上分別稱取肺組織干重，最后按公式計算：肺濕重

11、與干重比值=（濕重-干重）/干重。1.2.6 肺組織MDA含量、SOD活性、MPO活性嚴(yán)格按試劑盒說明書制備樣品，并用分光光度計測定吸光度值，再通過公式計算出組織勻漿液中的MDA含量、SOD活性和MPO活性。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 形態(tài)學(xué)觀察光鏡下，對照組肺泡腔內(nèi)無水腫、出血及壞死，間隔無增寬，無炎細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)清晰可見。肺I/R組肺泡腔內(nèi)明顯出血、水腫，血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤明顯，并有局灶性肺氣腫，肺泡間隔增寬，偶見局灶性壞死，組織、細(xì)

12、胞結(jié)構(gòu)紊亂。HPC+I/R組可見少量的炎性細(xì)胞浸潤，少量肺泡間隔出現(xiàn)斷裂，無明顯出血、水腫，組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍清晰，損傷程度較肺I/R組明顯減輕，見圖1。2.2 肺組織濕重與干重比值，見表1。結(jié)果表明HPC能減輕肺組織的I/R損傷，減輕肺水腫。表1 各組肺組織濕重與干重比值（略）注：與對照組比較，(1)P<0.05； 與I/R組比較，(2)P<0.05。2.3 肺組織MDA含量及SOD、MPO活性見表2。結(jié)果提示HPC能有效地抑制肺I/R時的氧化應(yīng)激反應(yīng)及中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的作用。表2 肺組織MDA含量及MPO、SOD活性的變化（略）注：與對照組比較，(1)P&l

13、t;0.05；(2)P<0.01； 與肺I/R組比較：(3)P<0.05，(4)P<0.01。3 討論自1960年Jennings第一次提出I/R損傷的概念后，再灌注損傷日益受到重視。1986年，Murry等5首先發(fā)現(xiàn)了IPC現(xiàn)象，之后人們以雞胚、鼠科動物、兔、狗，乃至人體為研究對象，進(jìn)一步證明了IPC/HPC是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，但確切機(jī)制尚不明確，其可能的機(jī)制包括谷氨酸和腺苷受體激活、ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、氧化應(yīng)激等。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠HPC模型的基礎(chǔ)上，再復(fù)制大鼠單側(cè)肺I/R損傷模型，觀察HPC對肺I/R損傷的影響。肺I/

14、R損傷后的基本病理改變是肺毛細(xì)血管通透性增高, 表現(xiàn)為血管內(nèi)滲出物增多、肺濕重與干重比值增加、蛋白漏出、肺通透性指數(shù)增高等6。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺I/R后，肺組織濕重與干重比值較對照組明顯增高，而經(jīng)過HPC后再進(jìn)行肺I/R，肺組織濕重與干重比值明顯回降, 表明肺毛細(xì)血管損傷程度大大減輕。光鏡下，肺I/R組肺泡腔內(nèi)可見明顯的出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤，組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂；HPC+肺I/R組雖有少量炎細(xì)胞浸潤及局灶性改變，但比肺I/R組肺組織病理改變明顯減輕，表明HPC減輕了I/R對肺組織的損傷作用。肺I/R時由于氧自由基過量產(chǎn)生和組織抗氧自由基能力失衡, 導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生, 從而引起組織損傷。肺I/R時

15、肺組織可以通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，白細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”等途徑產(chǎn)生大量的氧自由基，同時內(nèi)源性的抗氧化酶類，如SOD等被消耗，導(dǎo)致抗氧化能力下降，引發(fā)肺組織的脂質(zhì)過氧化損傷。MDA是過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物, 其含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺I/R組肺組織的SOD活性明顯降低，而MDA的含量明顯增高；HPC+肺I/R組雖然與對照組比較SOD有所降低，MDA含量有所增高，但差異無顯著性 (P>0.05)，但與I/R組比較差異有顯著性。這些結(jié)果表明，HPC可以顯著提高機(jī)體的抗氧化能力, 減輕肺I/R時氧自由基對肺組織的損傷，從而起到對肺的保護(hù)作用。MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒所釋

16、放的過氧化物酶類，其含量與中性粒細(xì)胞數(shù)量有極顯著的相關(guān)性, 檢測組織中MPO含量往往可以反映中性粒細(xì)胞浸潤的程度及活性7。肺I/R損傷過程中，中性粒細(xì)胞浸潤、激活是引起肺I/R損傷的主要原因之一8 。實(shí)驗(yàn)顯示，肺I/R組肺組織MPO活性比對照組有明顯升高，而HPC+I/R組與 I/R組相比較明顯降低，表明肺I/R后有大量的炎性細(xì)胞浸潤、激活，引起肺組織損傷，而HPC后MPO活性明顯降低，說明HPC能夠抑制中性粒細(xì)胞浸潤、激活，因而可起到減輕肺I/R損傷的作用。本研究顯示，HPC能夠減輕肺組織的I/R損傷，這與國外文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示HPC的保護(hù)作用可能通過改善肺毛細(xì)血管的通透性

17、、減輕肺的氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少中性粒細(xì)胞的聚集等機(jī)制得以實(shí)現(xiàn)。【參考文獻(xiàn)】 1 Featherstone RL, Chambers DJ, Kelly FJ. Ischemic-preconditioning enhances recovery of isolated rat lungs after hypothermic preservation J. Ann Thorac Surg, 2000(1): 237.2李建華, 司志萍，盧佳怡，等.缺血預(yù)處理對大鼠肺缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用J. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2003(2): 137-140.3Pilla ES, Vendrame GS,

18、Sánchez PG,et al.Ischemic preconditioning by selective occlusion of the pulmonary artery in rats J. J Bras Pneumol，2008(8):583-589.4呂國蔚, 史美棠, 李凌, 等。急性重復(fù)缺氧對小鼠缺氧耐受性的影響及其機(jī)制的初步探討J.中國病理生理雜志,1992(4):425-429.5Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium J. Circulation, 1986(74):1124-1136.6Friedrich I, Spillner J , Lu EX, et al. Ischemic pre-conditioning of 5 minutes but not of 10 minutes improves lung func