863課題申請書抗腫瘤反義核酸藥物

1、 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）課題申請書 領(lǐng)域名稱： 生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù) 主題（重大專項）名稱： 生物工程技術(shù) 所屬專題名稱： 新型生物技術(shù)藥物和疫苗的研究 課題名稱： 抗腫瘤反義核酸藥物“癌泰得”的臨床前研究 申 請 人： 申請人單位： 通訊地址： 郵 編： 聯(lián)系電話： 傳真： 電子郵箱： 中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部二一年 九 月 二十 日填 寫 要 求一、 請嚴(yán)格按表中要求填寫各項；二、 對于第一部分中的多選欄目，采用在所選項編號上劃勾的方式確定；三、 申請書文本中外文名詞第一次出現(xiàn)時，要寫清全稱和縮寫，再出現(xiàn)同一詞時可以使用縮寫；四、 申請書文本采用a4幅面紙，可以自行以同樣幅面紙

2、復(fù)制，填寫內(nèi)容需打印填入,對于篇幅不夠的欄目可自行加頁；五、 專利查新結(jié)論及其他附件需與本申請書裝訂成一冊,一并報送；六、 表中單位性質(zhì)、所在地區(qū)和所屬部門代碼請查閱863計劃網(wǎng)站 ()：863計劃課題信息有關(guān)代碼對照表。一、 基本信息課題申請人情況姓名性別01.男02.女出生年月文化程度01.研究生 02.大本03.大專 04.大專以下職稱01. 高級職稱 02.中級職稱03.初級職稱 04.無職稱聯(lián)系電話e-mail課題申請單位名稱通訊地址郵編單位性質(zhì)事業(yè)型研究單位代碼aa參加單位總數(shù)2所在地區(qū)（省、自治區(qū)、直轄市、計劃單列市）代碼所屬部門（國務(wù)院各部、委、局及其機構(gòu)）代碼其它主要聯(lián)合申請

3、單位單位名稱參加形式1.合作 2.協(xié)作單位性質(zhì)（同上）課題活動類型01.應(yīng)用基礎(chǔ)研究 02.應(yīng)用技術(shù)開發(fā) 03.試驗發(fā)展 04.軟科學(xué)成果提供形式01.發(fā)明專利 02.新產(chǎn)品（或農(nóng)業(yè)新品種） 03.新裝置 04.新材料 05.新工藝（或新方法、新模式）06.計算機軟件 07.技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)08.論文論著09.其它總經(jīng)費概算 800.00 萬元擬申請863計劃資助（萬元）400.00 萬元其他經(jīng)費來源（萬元）（請將提供經(jīng)費方出據(jù)的同意提供經(jīng)費的證明，作為其他附件附后。）科技部其他科技計劃資助國家其他資助(包括部門匹配)地方政府匹配銀行貸款自有資金其它資金 (風(fēng)險投資)400.00 萬元合 計800.0

4、0 萬元預(yù)計完成年限2004.12申報日期2001.10.所在單位 合計： 13.5 人年在課題中職務(wù)（組長、副組長或成員）及分擔(dān)的任務(wù)組長：課題設(shè)計及組織實施副組長：臨床前動物試驗反義核酸合成純化工藝及制劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（生物質(zhì)譜）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（hplc、ce）藥代動力學(xué)實驗一般毒理學(xué)試驗三致試驗藥效學(xué)研究申報臨床試驗資料撰寫活性測定方法的建立為本課題工作時間（人年）0.80.50.50.40.40.40.30.30.30.20.20.2專 業(yè)腫瘤生物學(xué)藥理毒理學(xué)藥物分析藥物化學(xué)藥物分析藥物分析藥理學(xué)藥理學(xué)藥理學(xué)藥理學(xué)生物化學(xué)分子生物學(xué)職務(wù)/職稱副 研副 研博 士助 研助 研助 研副 研博 士助 研助

5、 研助 研副 研二、課題組主要研究人員情況出生年月性別姓 名序號1234567891011121課題組長、副組長資歷情況(從事過的主要研究任務(wù)及所負責(zé)任和作用，研究成果和獲發(fā)明專利情況，在國內(nèi)外主要刊物上發(fā)表論文情況。)課題組長: 腫瘤生物學(xué)專業(yè)，副研究員1995年開始端粒酶的研究，主要研究端粒酶的純化、活性及rna檢測。1997年開始進行端粒酶與腫瘤基因調(diào)控關(guān)系、反義寡核苷酸及合成藥物抑制端粒酶活性等研究。在國內(nèi)率先建立了端粒酶活性測定技術(shù)。1998年應(yīng)邀在第17屆國際癌癥大會上宣讀有關(guān)端粒酶rna反義核酸的論文。曾先后兩次在德國從事反義寡核苷酸抑制端粒酶活性的研究工作。從事過的主要研究任務(wù)

6、及所負責(zé)任和作用:(1)，國家自然科學(xué)基金題（1994）, 課題負責(zé)人。(2)國家自然科學(xué)基金題(1997)，課題負責(zé)人。(3)，國家自然科學(xué)基金題（1998），課題負責(zé)人.(4)省自然科學(xué)基金題1997，課題負責(zé)人。(5)省醫(yī)藥衛(wèi)生優(yōu)秀青年人才基金題(1999)，課題負責(zé)人。研究成果和發(fā)明專利:獲1994年省科技進步獎三等獎大學(xué)優(yōu)秀青年科技工作者(1995年)國內(nèi)外刊物發(fā)表文章: 副組長:，藥理毒理學(xué)專業(yè)，副研究員1994年畢業(yè)后開始從事新藥的臨床前評價，主要從事生物技術(shù)藥物的藥效學(xué)、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)研究。從事過的主要研究任務(wù)及所負責(zé)任和作用:(1) 國家863項目參與其 中臨床前評價工作

7、。(2）國家自然科學(xué)基金題負責(zé)其中臨床前安全評價 和篩選工作。(3) 近8年與本單位和院外單位合作先后完成重組細胞因子、基因治療制劑和一些化 學(xué)藥品共40余項的臨床前安全性評價試驗，業(yè)務(wù)骨干或作為負責(zé)人。(4)負責(zé)一項分題“高通量抗輻射藥物 篩選”。(5)課題負責(zé)人。研究成果和發(fā)明專利:(國內(nèi)外刊物發(fā)表文章:(1)二、 課題情況三、1主要研究內(nèi)容、擬解決的技術(shù)難點，以及預(yù)期達到的目標(biāo)、主要技術(shù)指標(biāo)和水平 主要研究內(nèi)容 3年來在國家自然科學(xué)基金、國家“863”及多項基金資助下進行針對端粒酶催化亞單位（hest2）的反義寡核苷酸抗腫瘤研究。通過設(shè)計、合成、修飾和篩選得到一條抗腫瘤活性最佳的序列，對

8、裸鼠人移植性腫瘤的最大抑瘤率達89.9%，被命名為“癌泰得”。本課題目的在于對“癌泰得”臨床前研究中的中試生產(chǎn)、藥理毒理學(xué)等進行研究，從而開發(fā)出國內(nèi)第一個具有抗腫瘤活性的新型反義類藥物。(1) “癌泰得”的藥學(xué)研究l 中試研究：生產(chǎn)工藝研究產(chǎn)品質(zhì)量, 三批中試產(chǎn)品制造，檢定規(guī)程，制劑，初步穩(wěn)定性試驗l 藥學(xué)其它：序列測定，生產(chǎn)用原料質(zhì)控，標(biāo)準(zhǔn)品制備和檢定，處方確定(2) “癌泰得”的臨床前藥理學(xué)和毒理學(xué)研究l 藥理學(xué)研究：主要藥效學(xué)，一般藥理學(xué)試驗，藥代動力學(xué)試驗l 毒理學(xué)研究：單次給藥和重復(fù)給藥毒性試驗，特殊毒理和免疫毒性試驗(3) “癌泰得”申報臨床試驗l 三批中試產(chǎn)品送檢l 撰寫申報臨床

9、試驗的文件并申報擬解決的關(guān)鍵技術(shù)難點(1) 中試生產(chǎn)的規(guī)模。目前我們已有克級的dna合成儀，臨床試驗時要求達公斤級 的dna合成儀，如oligo process system，屆時將由合作的公司購買。(2) 在臨床前藥代動力學(xué)研究中血液和組織中反義寡核苷酸原型藥的檢測及方法的靈 敏度能否達到要求。預(yù)期達到的目標(biāo) 按i類新生物制品要求完成臨床前所有工作并獲得臨床試驗的批文。主要技術(shù)指標(biāo)和水平l 中試生產(chǎn)規(guī)模達10克/批以上（臨床試驗前達到500g-1000g/天）平均縮合率大于98.5%，產(chǎn)品純度大于95，回收率80%以上。滿足臨床前研究的要求。l 主要藥效學(xué)試驗中，依給藥劑量和給藥持續(xù)時間，抑

10、瘤率在40%-70。l 藥代動力學(xué)試驗中，原型藥和代謝產(chǎn)物檢測方法的靈敏度能檢出3-5個半衰期后的血藥濃度，檢出相差1個堿基的代謝產(chǎn)物。l 毒理學(xué)試驗中，端粒酶的反義寡核苷酸的安全劑量應(yīng)高于藥效學(xué)有效劑量，毒性限制劑量應(yīng)在藥效學(xué)有效劑量的10倍以上。2預(yù)期可獲得的發(fā)明專利等知識產(chǎn)權(quán)情況獲利發(fā)明專利12項。3課題主要研究技術(shù)內(nèi)容的國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢，國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，以及與課題有關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域的國內(nèi)外專利申請和授權(quán)情況（附有關(guān)專利查新結(jié)論）(1) 國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢及國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ):反義藥物可在基因水平特異性阻斷特定基因的表達，因此被認為是一種很有希望的高選擇性和高效率的潛在疾病治療藥物。隨

11、著功能基因組學(xué)的深入研究，將會有越來越多的疾病相關(guān)基因及藥物作用靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)。反義核酸作為以基因為藥靶的新一代藥物將發(fā)揮更大優(yōu)勢。目前利用反義核酸作為藥物和基因功能研究的文獻呈爆發(fā)式增加的趨勢。目前已有一種反義核酸在美國上市，另有16種反義核酸藥物在進行臨床實驗。國內(nèi)在該領(lǐng)域也做了大量的研究工作，但沒有一個反義藥物進入臨床試驗階段，有待于在靶標(biāo)的選擇和合成規(guī)模等方面取得重大突破。隨著人類基因組計劃的深入，特別是后基因組計劃的實施，將會有越來越多的疾病相關(guān)基因及藥物作用靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)。反義核酸作為基因為靶的新一代藥物將會發(fā)揮其更大的優(yōu)勢。端粒(telomere)是真核細胞染色體末端一段重復(fù)dna序列，

12、其功能是保持染色體的穩(wěn)定性。端粒dna的長短和穩(wěn)定性決定了細胞壽命，并與細胞的癌變密切相關(guān)。端粒酶是由一條單鏈rna(htr)和一些蛋白質(zhì)亞單位組成的核糖核蛋白復(fù)合物。研究結(jié)果表明，惡性腫瘤端粒酶陽性率為85-90%；正常組織除胚細胞和造血細胞外，無端粒酶活性，癌旁組織端粒酶陽性率為6%；良性瘤和癌前病變組織端粒酶陽性率為14%。這表明端粒酶在癌細胞的形成和增殖中起著重要的作用。端粒酶作為惡性腫瘤標(biāo)志物愈來愈被人們所接受。研究表明端粒酶的抑制可引起腫瘤細胞凋亡或誘導(dǎo)其分化, 抑制端粒酶的活性有可能抑制癌細胞的生長，從而達到治療癌癥的目的。因而端粒酶被認為是潛在的腫瘤治療新靶點。國外有人針對端粒

13、酶rna部分設(shè)計了一種錘頭型核酶，在體外可以切割端粒酶rna，抑制端粒酶活性。norton等針對端粒酶rna模板區(qū)設(shè)計合成了不同長度的硫代反義寡核苷酸(s-asodn)和肽核酸(pna)對惡性腫瘤細胞提取物中的端粒酶和細胞內(nèi)的端粒酶均有不同程度的抑制作用。feng等構(gòu)建了反義 htr表達載體，轉(zhuǎn)染hela細胞，經(jīng)過23-26代，細胞端?？s短，細胞開始死亡。mata等使用6個堿基硫代反義寡核苷酸（ttaggg）抑制burkitt 淋巴細胞體外生長和接種裸鼠的腫瘤生長均取了較好的結(jié)果。(2) 與課題有關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域的國內(nèi)外專利申請及授權(quán)情況（附有關(guān)專利查新結(jié)論）: 有關(guān)端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白亞基

14、及其反義藥物的抗腫瘤研究國內(nèi)外均有專利申請，其中國內(nèi)專利屬于課題組前期工作，國外專利也有一項屬于本課題組的工作。4課題擬采取的研究方法（或技術(shù)路線、實施方案）及其可行性和風(fēng)險分析研究方法:(1) “癌泰得”的中試研究l 生產(chǎn)工藝的研究：采用固相“流過式”自動法合成，離子交換反相法純化產(chǎn)品。l 中試產(chǎn)品質(zhì)量研究和活性測定方法建立：采用毛細管電泳檢測產(chǎn)品純度，結(jié)構(gòu)采用質(zhì)譜法，定量采用hplc法，活性采用體外端粒酶活性測定法。l 中試產(chǎn)品生產(chǎn)和檢定規(guī)程草案。l 三批中試產(chǎn)品的初步穩(wěn)定性試驗和制劑處方的研究。l 三批中試品的送檢。l 端粒酶反義寡核苷酸序列的確證：采用生物質(zhì)譜法。(2) “癌泰得”的臨

15、床前藥理學(xué)和毒理學(xué)研究l 主要藥效學(xué)研究：在體外進行抗瘤譜的篩選。再進行敏感瘤株的體外和體內(nèi)（裸鼠）抗瘤試驗。至少重復(fù)三次。嚴(yán)格設(shè)置陽性對照藥。l 一般藥理學(xué)試驗：在安全劑量范圍內(nèi)觀察端粒酶反義寡核苷酸對精神、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響。l 藥代動力學(xué)研究：觀察反義序列的組織器官分布、測定藥代動力學(xué)參數(shù)（vc、t1/2 和cls等）和代謝轉(zhuǎn)化。采用固相提取法、毛細管凝膠電泳、熒光標(biāo)記和質(zhì)譜分析相結(jié)合方法檢測。l 毒理學(xué)試驗。觀察單次給藥和重復(fù)給藥后在動物的潛在毒性和毒性靶器官。(3) 撰寫申報“癌泰得”臨床試驗的資料，申報臨床試驗?？尚行苑治龊惋L(fēng)險分析:(1) 技術(shù)及條件的可行性：課題組成員已

16、掌握反義寡核苷酸的合成、化學(xué)修飾、純化及端粒酶活性檢測等方面技術(shù)。在臨床前評價方面，課題組成員從事生物技術(shù)藥物臨床前評價已有多年，建立了較為完整的生物技術(shù)藥物臨床前評價的實驗技術(shù)和方法，同時有較多的有關(guān)反義核酸藥物臨床前評價的國外文獻資料可供借鑒。因此從技術(shù)上完成本課題的工作是可行的。(2) 工作基礎(chǔ)：前期工作包括合成方法研究、三批小試合成和純化、質(zhì)量檢驗、ld50、藥效學(xué)試驗和采用熒光標(biāo)記結(jié)合ce測定反義寡核苷酸的濃度等。結(jié)果表明，我們所設(shè)計和合成的“癌泰得”毒性?。╨d50大于1g/kg），對肝癌(hepg2)、肺癌(glc)、腦膠質(zhì)瘤(bt325)、胃癌(bgc823)及乳腺癌(mcf-

17、7)細胞均有不同程度的抑制作用，具有明顯的抗裸鼠移植性腫瘤生長作用。因此，預(yù)計通過對端粒酶反義寡核苷酸進行系統(tǒng)的臨床前研究最終能進入臨床試驗。(3) 風(fēng)險分析：本課題的難點在于中試生產(chǎn)和臨床前藥代動力學(xué)方法學(xué)的研究。反義寡核苷酸可采用自動化dna合成儀合成，目前國外有10g-500g/批合成規(guī)模的商業(yè)化儀器。由于采用自動化合成，因此能滿足臨床前的中試生產(chǎn)規(guī)模要求。在藥代動力學(xué)方法學(xué)研究方面，有基因重組產(chǎn)品的藥代動力學(xué)研究的豐富經(jīng)驗，近年我們對反義核酸的檢測方法進行了探索，采用熒光標(biāo)記方法，結(jié)合毛細管凝膠電泳法可達到定量檢測的要求。因此要達到本課題目標(biāo)的風(fēng)險較小。5預(yù)期研究成果應(yīng)用轉(zhuǎn)化的前景預(yù)測

18、及分析（包括國內(nèi)外應(yīng)用或市場現(xiàn)狀、潛在用戶、市場前景及風(fēng)險預(yù)測, 經(jīng)濟效益和社會作用、影響分析等）國內(nèi)外應(yīng)用或市場現(xiàn)狀：目前已有16種反義寡核苷酸藥物進入臨床試驗，包括針對感染性疾病、癌癥及炎癥的反義寡核苷酸，有1種藥物獲得fda批準(zhǔn)進入市場。反義藥物在臨床前實驗及臨床試驗中取得了喜人的結(jié)果，進一步促進了反義技術(shù)的發(fā)展。但目前無針對端粒酶的反義藥物進入臨床試驗。潛在用戶及市場前景及風(fēng)險預(yù)測：本課題的研究成果，獲利新藥臨床試驗的批文。目前國內(nèi)尚無反義類藥物進入臨床試驗。由于國外反義藥物試驗結(jié)果較好，陸續(xù)有反義藥物進入臨床試驗，反義藥物逐漸受到國內(nèi)外重視。我們研究的針對端粒酶的反義藥物，藥靶明確及

19、特異，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有較強的抗腫瘤活性。目前已有企業(yè)合作，愿共同出資開發(fā)這一新藥。藥物治療是惡性腫瘤的主要治療方法之一。但目前市場上缺少針對特定靶分子、效果較為理想的抗腫瘤藥物，尤其是對實體瘤和耐藥腫瘤的有效的藥物。因此，本課題最終成果應(yīng)具有較好的市場前景。由于本課題具有較好的先期工作基礎(chǔ)，表明其質(zhì)量可控和有效，參照國外經(jīng)驗，我們認為達到本課題目標(biāo)的風(fēng)險較小。經(jīng)濟效益和社會作用、影響分析等：腫瘤是目前威脅人類健康的最重要疾病之一，是人類健康和生命的頭號殺手，發(fā)病率居10 種重大疾病的第二位，而且隨著各種因素的影響其發(fā)病率依然呈上升趨勢。據(jù)報導(dǎo)目前歐美每年診斷出的癌癥新患者達250萬。我國每年死

20、于癌癥的患者超過80萬。據(jù)專家預(yù)測世界抗癌藥物的市場年遞增13。從上述完全統(tǒng)計的數(shù)字可以看出研究和開發(fā)抗癌藥物，特別是新型抗癌藥物有僅具有非常重要的社會效益，而且其經(jīng)濟效益也是其它藥物所無法比擬的。根據(jù)目前我國抗腫瘤生物制品的市場情況保守估計，該項目最終上市投產(chǎn)后平均年利潤應(yīng)超過5億元人民幣。6課題現(xiàn)有工作基礎(chǔ)與申請單位承諾提供的支撐條件，其他所需增添的支撐條件和主要儀器設(shè)備（說明用途）工作基礎(chǔ)：(1) 藥學(xué)初步研究l 已進行了三批小規(guī)模“癌泰得”的合成、純化及質(zhì)量控制方法的研究。利用本室的dna合成儀合成了三批“癌泰得”，平均縮合率達98.5±0.5%。采用陰離子加反相柱層析法純化

21、了三批合成硫代“癌泰得”，平均回收率85.0±2.0%。，用陰離子交換hplc和毛細胞管凝膠電泳方法對硫代hest212進行定性分析和質(zhì)量控制，可分辨n-1及非硫代“癌泰得”。l 針對人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基（hest2）的反義寡核苷酸的靶位篩選和序列長度的優(yōu)化。根據(jù)序列和rna二級結(jié)構(gòu)特征，利用相應(yīng)軟件設(shè)計和合成了20條硫代反義寡核苷酸，觀察在體外和體內(nèi)的抗腫瘤活性。其中一條序列“癌泰得”抑瘤率達89.9%，申請了中國和國際專利。國內(nèi)專利公開號為cn1253179a，國際專利號為pct/cn99/00173。(2) 臨床前藥理毒理學(xué)初步研究l “癌泰得”作用的序列特異性分

22、析。通過合成正義、隨機（堿基組成相同）及錯配的序列（gc含量相同）及硫代修飾，在體外觀察到“癌泰得”（0.2、0.4和0.8mmol/l）抑制腫瘤細胞生長（hepg2）最高達65.0%，表明“癌泰得”的序列作用特異性。l “癌泰得”抗瘤譜和作用時間的研究。在體外觀察到“癌泰得”對胃癌細胞（bgc-823）作用最強（ec50為0.25mmol/l），對肝癌、肺癌和乳腺癌的作用強度中等。連續(xù)作用4天，“癌泰得”的體外抗瘤活性達峰值。l “癌泰得”對裸鼠肝移植瘤抗癌活性的研究。腹腔注射10天“癌泰得”12.5 mg/kg、25 mg/kg和50mg/kg，抑瘤率分別為29.4%、 47.9%和52.

23、7%。靜脈注射25mg/kg抑瘤率為49.3%。其中連續(xù)腹腔注射“癌泰得”（6.2 mg/kg、12.5 mg/kg和25mg/kg）30天，最大抑瘤率達80以上。l 單次給藥毒性試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)“癌泰得”在雌性小鼠的ld50為1173.9 mg/kg，雄性小鼠的ld50為1098.8mg/kg。提供的支撐條件l 人員: 具有多學(xué)科長期從事反義核酸、細胞生物學(xué)、藥理學(xué)、藥物分析及臨床前安全性評價等的專門人才參與本課題研究。大多數(shù)是具有博士或碩士學(xué)位的年輕人且在各自的研究領(lǐng)域有一定的工作經(jīng)驗。l 已有的儀器設(shè)備: akta oligopilot(amersham-pharmacia,14萬usd)

24、及390z(abd公司，11.7萬usd)大規(guī)模dna合成儀2臺，用于組合寡核苷酸庫、體內(nèi)外活性實驗用反義寡核苷酸的合成。3900高通量(48柱，abd公司，13.0萬usd)、單柱(abd,2.0萬usd)和雙柱(abd,3.0萬usd)小規(guī)模dna合成儀共3臺，用于體外篩選和優(yōu)化用多個小規(guī)模反義寡核苷酸的合成。制備和分析型高效液相色譜儀各1臺(waters,10.0萬usd)，用于寡核苷酸的純化和分析。毛細管電泳儀(backman,mdq，6萬usd)，用于寡核苷酸質(zhì)量分析。還有自動基因序列分析儀、g計數(shù)儀、全自動生化分析儀、全自動細胞計數(shù)儀、顯微自動成像儀、組織切片機和八道生理分析儀等。

25、尚缺儀器設(shè)備 從事該研究無需購置任何大型儀器和設(shè)備。7合作單位任務(wù)分工反義核酸合成和組織申報臨床試驗。四、審核意見1申請人所在單位意見 本項目符合863招標(biāo)指南的各項要求，項目科學(xué)性強，研究方案可行，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。經(jīng)本單位審查，同意上報。如獲得資助，本單位將在人力、財力和設(shè)備方面給予優(yōu)先支持。 簽 章 二00 年 九 月 二十五 日2聯(lián)合申請單位意見聯(lián)合申請單位（一） 簽 章 二00 年 月 日聯(lián)合申請單位（二） 簽 章 二00 年 月 日聯(lián)合申請單位（三） 簽 章 二00 年 月 日附件：有關(guān)專利查新結(jié)論 通過檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫、medline數(shù)據(jù)庫、中國專利數(shù)據(jù)庫和es

26、pcenet世界專利數(shù)據(jù)庫，有關(guān)端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白亞基及其的反義藥物的抗腫瘤研究國內(nèi)外均有文獻報道，其中國內(nèi)部分報道屬于本課題組（國內(nèi)文獻（1）（6），并為首先開展研究；有關(guān)專利國內(nèi)外均有報道，其中國內(nèi)專利屬于本課題組（專利文獻1），國外專利中（專利文獻2）也有一項屬于本課題組。其他附件（1）科技查新項目報告書。（2）國內(nèi)發(fā)明專利申請公開說明書。（3）申請專利合作條約請求書（4）抗腫瘤基因反義藥物“癌泰得”合作研究與開發(fā)合同。登記序號： 項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項目課題設(shè)計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關(guān)節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機理研究申報單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負責(zé)人： 朱萱萱計劃年限

27、：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。五、計劃進度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進度，分

28、別列出具體的目標(biāo)和進度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)

29、查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔(dān)。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對oa的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥

30、治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進行深入的機理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對oa進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增

31、高的趨勢。felson等報道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占

32、12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險相應(yīng)減少50%。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我

33、國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，oa的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導(dǎo)致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)

34、，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認為自由基對軟骨細胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補體等作用能釋放大量o2-和h2o2；細胞因子學(xué)說：細胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（il-1）、白細胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。i

35、l-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制

36、劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞糖酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學(xué)說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)

37、重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時軟骨細胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過as途徑加劇軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸

38、傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達遠高于未受損區(qū),提示fas表達可誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡。除no途徑和fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治

39、療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬

40、臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療

41、oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進展隨著對oa發(fā)病機理的不斷深入認識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對o

42、a的動物實驗，并采用相關(guān)的指標(biāo)進行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標(biāo)來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用pt-pcr技術(shù)測定nos基因表達。il-1、il-6、tnf等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細胞的細胞凋亡及增

43、殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標(biāo)使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤。基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對oa發(fā)病機理的深入研究，我們在補益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總

44、結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發(fā)病的可能

45、機理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進行設(shè)計并立題。1.4本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝oa模型，從發(fā)病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復(fù)制動物模型，并采用最新的檢測指標(biāo)il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對oa發(fā)病機制的最新研究成果，從生化、免疫等多個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內(nèi)外運用中藥治療oa的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的

46、影響）研究中藥對oa的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療oa的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療oa的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗?zāi)Ｐ图白钚碌膰H公認的相關(guān)指標(biāo)進行實驗研究，觀察其對oa的確

47、切療效及作用機理，這必將對oa的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入wto與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)掘出的治療oa的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻。2.科研假說或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討oa的病因病機，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展實驗研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生化學(xué)等多方面來探討“痛痹

48、顆粒”治療膝oa的療效機制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵2.2.1膝oa模型的復(fù)制目前所使用的oa動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)oa產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動物自發(fā)oa，如c57黑鼠等。在選擇動物模型時一般應(yīng)考慮動物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機制和oa模型的特點，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的oa模型，且操作較為簡單。具體的造模機制在于低應(yīng)

49、力可以造成軟骨厚度減少，so染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動物模型。用于動物模型的動物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做oa模型，因為該模型關(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類相似，且動物來源較廣泛，且經(jīng)濟。2.2.2關(guān)節(jié)軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴(yán)格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細胞。目前還沒有專門用于軟骨細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、f12、改良eagle等，國內(nèi)的有199、1640、dmem（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用dmem