基因治療的原理 (2)ppt課件

1、采礦工程采礦工程01 二零一零年十一月七號(hào)二零一零年十一月七號(hào)3一、基因治療的策略一、基因治療的策略 內(nèi)容提要內(nèi)容提要二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 三、基因干預(yù)三、基因干預(yù) 目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。 對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。 6要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/1001

2、/100萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)重組的檢出率最高可達(dá)1/101/10。7（二）（二） 基因添加基因添加 基因添加或稱基因增補(bǔ)（基因添加或稱基因增補(bǔ)（gene augmentationgene augmentation）: : 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型類型: :n在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正常基因，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；除去，通過導(dǎo)

3、入正常基因的表達(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；n向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。病的目的。8（三）基因干預(yù)（三）基因干預(yù)l基因干預(yù)（基因干預(yù)（gene interferencegene interference）: : 采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。12基因治療的兩種途徑基因治療的兩種途徑載體載體目的基因目的基因in vivoex v

4、ivo靶細(xì)胞14 1. 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%71%的病例使用了病毒載體，的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。15Retrovirus逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒 16逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由兩部分組成：由兩部分組成： (1) (1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (2) (2) 輔助細(xì)胞株輔

5、助細(xì)胞株( (如如PA317)PA317)17 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由envenv編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。性受體識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影響其他部分的活性。的缺失不影響其他部分的活性。 前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外

6、源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。達(dá)。 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。 18 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn) 隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。19 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AV)

7、AV)載體載體 腺病毒是一種大分子腺病毒是一種大分子(36 kb)(36 kb)雙鏈無包膜雙鏈無包膜DNADNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。

8、20AAV Virus Particles26 2.2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1 1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 基本原理基本原理: :利用陽離子脂質(zhì)體單體與利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNADNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNADNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNADNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞

9、內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。 27 （2 2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將將DNADNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNADNA具有靶向性。具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNADNA結(jié)合，結(jié)合，將將DNADNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源特異性受體的靶細(xì)

10、胞吞飲，從而將外源DNADNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。導(dǎo)入靶細(xì)胞。28 （3 3）基因直接注射技術(shù)）基因直接注射技術(shù) 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNADNA注入動(dòng)物肌肉注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)?；蚰承┢鞴俳M織內(nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 1.1.將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加壁內(nèi)毛細(xì)血管增

11、加30%30%40%40%； 2.2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；島素； 3.3.肌內(nèi)注射凝血因子肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等?；颍僧a(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。29 基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)1.1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNADNA重組體的技術(shù)較容易；重組體的技術(shù)較容易；2.2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生導(dǎo)

12、入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；4.4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。治療效果下降。 （一）反義（一）反義RNARNA 1. 1. 反義反義RNARNA與基因表達(dá)調(diào)控與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義利用反義RNARNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種：有兩種： （1 1）體外合成反義）體外合成反義RNARNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)

13、胞，細(xì)胞吸收，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNARNA后，發(fā)后，發(fā)揮作用。揮作用。 （2 2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNARNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNARNA而發(fā)揮作用。而發(fā)揮作用。34 3. 3. 反義反義RNARNA的應(yīng)用前景的應(yīng)用前景 受體介導(dǎo)的反義受體介導(dǎo)的反義RNARNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。 （l l）安全性高）安全性高 （2 2）反義）反義RNARNA設(shè)計(jì)和制備方便設(shè)計(jì)和制備方便 （3 3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)）具有劑

14、量調(diào)節(jié)效應(yīng) （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反義反義RNARNA只作用于特異的只作用于特異的mRNAmRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義基因的結(jié)構(gòu)。反義RNARNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留胞內(nèi)部被降解，不留“殘?jiān)鼩堅(jiān)薄?在治療在治療RNARNA病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義RNARNA基因治療比一般基因治療比一般的的DNADNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNARNA，阻，

15、阻斷斷RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。373.RNA3.RNA干擾的應(yīng)用前景干擾的應(yīng)用前景 RNARNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。40 （3 3） 病毒性疾病的基因治療病毒性疾病的基因治療 RNARNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用siRNAsiRNA抑制抑制人類免疫

16、缺陷病毒（人類免疫缺陷病毒（HIVHIV）某些基因的表達(dá)，如）某些基因的表達(dá)，如P24P24、VifVif、nefnef、tattat或或revrev，阻礙，阻礙HIVHIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNARNA干擾技術(shù)抑制干擾技術(shù)抑制HIVHIV的受體（的受體（CD4CD4）或輔）或輔助受體（助受體（CXCR4CXCR4或或CCR5CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIVHIV感染細(xì)胞。也可通過感染細(xì)胞。也可通過RNARNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎

17、病毒等。毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。41 siRNAsiRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNAsiRNA所阻斷，所阻斷，RNARNA干擾干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴(yán)重的病毒技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。性疾病的防治具有十分重大的意義。42（三）核酶（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多為單一的天然核酶多為單一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切

18、作 用。但核酶也可以由兩個(gè)用。但核酶也可以由兩個(gè)RNARNA分子組成。分子組成。 在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶RNARNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫唬纬煞肿又羞m當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNARNA分子切斷，通過破壞靶分子切斷，通過破壞靶RNARNA分子達(dá)到治療疾病分子達(dá)到治療疾病（如清除病毒基因組（如清除病毒基因組RNARNA）的目的。）的目的。 只要兩個(gè)只要兩個(gè)RNARNA分子通過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（分子通過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3 3個(gè)個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（1313個(gè)或個(gè)或1111個(gè)保守核苷酸序列），個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。43 1. 核酶的設(shè)計(jì)核酶的設(shè)計(jì) 核酶是通過靶核酶是通過靶RNARNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)