脂多糖誘導(dǎo)小鼠肝損傷介質(zhì)水平變化及五靈膠囊的作用

1、脂多糖誘導(dǎo)小鼠肝損傷介質(zhì)水平變化及五靈膠囊的作用作者：劉明義，王勝春，趙慧萍【摘要】 目的探討脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠肝損傷介質(zhì)水平變化及五靈膠囊的作用。方法小鼠尾靜脈注射（iv ）LPS 3.5mg/kg ，酶法檢測3，6，12和24 h小鼠血清ALT、 AST、 ALP、TRIG，化學(xué)法測定肝組織內(nèi)MDA、NOS水平，免疫組化檢測肝組織內(nèi)TNF-，CD14，iNOS，eNOS的陽性表達(dá)率。結(jié)果與正常組比較,小鼠iv 注射LPS 后3 h血清ALT，AST水平明顯升高并持續(xù)至12 h，24 h下降仍顯著高于正常組，ALP水平明顯持續(xù)下降。在12 h MDA含量顯著升高，24 h下降但明顯高于

2、正常組，而甘油三酯（TG）水平各時間點(diǎn)明顯升高，TNF-，CD14，iNOS，eNOS陽性表達(dá)率上調(diào)。五靈膠囊能明顯降低ALT，AST水平和MDA含量，對ALP和 TRIG水平無作用，抑制肝組織內(nèi)TNF-，CD14，iNOS，eNOS陽性表達(dá)率。結(jié)論MDA，TNF-，CD14，iNOS，eNOS參與了LPS誘導(dǎo)肝損傷，五靈膠囊抑制LPS誘導(dǎo)肝損傷的作用機(jī)制與抑制活性遞質(zhì)生成有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 肝損傷 一氧化氮合酶 活性介質(zhì) 脂多糖Abstract：ObjectiveTo explore the change of mediator levels in hepatic injured mice

3、induced by Lipoplysaccharide (LPS) and effects of Wuling capsule.MethodsLPS was given to mice by injection with a dose of LPS 3.5mg/kg via the tail vein, 3,6,12,24 hours later, the levels of ALT, AST, ALP in serum were detected by enzyme method and the contents of MDA, NOS in hepatic tissue of mice

4、were determined by chemistry, immunohistochemistry method was employed to determine the expression of TNF-, CD14, iNOS and eNOS in hepatic tissue. Results3 hours after LPS was given to mice, compared with normal group, the levels of ALT and AST were obviously elevated and persisted for 12 hours, and

5、 which were reduced in 24 hours but still high obviously as compared with normal group. The level of ALP were evidently decreased, and the content of MDA was significantly increased at 6 hour and lowered at 24 hours but still higher than normal. The level of triglycerides was increased and the expre

6、ssion of TNF- , CD14, iNOS ,eNOS in liver injury tissue was markedly up-regulated.ConclusionThe mediators as MDA, TNF-, CD14, iNOS ,eNOS participated in liver injury induced by LPS, the protective mechanism Wuling capsule liver injury might be related with inhibiting the release of mediators.Key wor

7、ds：Liver injury; Nitric oxide synthase; Activity mediators; Lipoplysaccharid 內(nèi)毒素血癥與肝損害可互為因果，從而對肝病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后產(chǎn)生重要的影響1。脂多糖（lipopolysaccharide LPS）致肝損傷機(jī)制諸多學(xué)者認(rèn)為：主要是通過激活枯否細(xì)胞（Kupffer cells KC）釋放細(xì)胞因子而介導(dǎo)肝細(xì)胞損害，LPS促進(jìn)枯否細(xì)胞合成釋放TNF-, 進(jìn)而促進(jìn)NO生成加重肝損傷2。早期研究表明五靈膠囊對LPS誘導(dǎo)枯否細(xì)胞釋放細(xì)胞因子有明顯抑制作用3，五靈膠囊具有疏肝健脾，扶正活血的作用，對內(nèi)毒素血癥肝損傷及介質(zhì)TN

8、F-，CD14，iNOS，eNOS表達(dá)有無影響還未經(jīng)證實(shí)，本文對此進(jìn)行了觀察，以便為臨床用藥提供依據(jù)。1 材料 動物：昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量（25±2）g，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，動物合格證號：SCK(軍)2002-05；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酯酶（ALP），甘油三酯（TG）,膽固醇(Chol)試劑盒（北京中生）；丙二醛（MDA）,一氧化氮合酶 （NOS）試劑盒（南京建成）； Rabbit anti-CD14，TNF-，NOS（iNOS），NOS（eNOS）一抗（武漢博士德）；S-P超敏試劑盒（福州邁新）；脂多糖（LPS）

9、（Sigma公司）；五靈膠囊（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科提供，批號：20040122），稱取五靈膠囊2 g，蒸餾水加熱溶解至10 ml為經(jīng)口給藥供試液。2 方法2.1 LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷血清酶實(shí)驗(yàn)取昆明小鼠96只，隨機(jī)分成3組（每組設(shè)4個時間點(diǎn)：3，6，12，24 h ）：正常組、LPS組、五靈膠囊組，每組每時間點(diǎn)8只。正常組和LPS組分別ig蒸餾水10 ml/kg，五靈膠囊組ig五靈膠囊2.0 g/kg，各組小鼠ig給藥1次/d，連續(xù)給藥5次，小鼠禁食自由飲水，末次給藥2 h后正常組各時間點(diǎn)小鼠尾靜脈注射(iv) 生理鹽水2 ml/kg，其余2組各時間點(diǎn)小鼠iv LPS 3.

10、5 mg/kg，iv后分別于3，6，12，24 h眼眶取血，放置30 min，離心，分離血清，酶法測定TRIG，ALT，AST，ALP。2.2 肝組織內(nèi)MDA、TRIG、 NOS測定和免疫組化實(shí)驗(yàn)迅速取上述實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟剔去膽囊，用冰冷生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干水分，除肝大葉外的肝組織制成10%肝勻漿，10 000 r/min離心，取上清按試劑盒說明書測定MDA、TRIG、NOS：肝大葉用10%甲醛（0.01 mol/L）磷酸緩沖液固定48h，石蠟包埋、切片，脫蠟至水洗,分別與抗CD14、抗TNF-、抗iNOS、抗eNOS（1100）進(jìn)行孵育，按試劑盒操作說明進(jìn)行免疫組化反應(yīng)，用二氨基聯(lián)苯胺（D

11、AB）-0.3 ml H2O2 /L系統(tǒng)顯色10 min。蘇木素襯染、脫水透明后，中性樹膠封片。陰性對照片用PBS替代一抗。結(jié)果評定：標(biāo)本無明確陽性反應(yīng)者為陰性，在40倍鏡下以Miaspro圖象分析系統(tǒng)程序掃描染色陽性細(xì)胞,每只小鼠肝組織掃描5個視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，結(jié)果以陽性細(xì)胞率表示。2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件，所測數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析。3 結(jié)果3.1 LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷不同時間血清酶的變化及五靈膠囊的作用血清酶學(xué)測試結(jié)果顯示，小鼠 iv LPS后3 h血清ALT值上升最高，隨著時間的延長其值逐漸下降，在24 h ALT值有所降低但仍明顯高于

12、正常組，AST水平3 h升高，12 h達(dá)最高，24 h下降仍明顯高于正常組；ALP 3 h明顯下降，隨著時間的延長其值下降更低。與LPS組比較，五靈膠囊組3h血清ALT和AST值高于LPS組，6 h與LPS組一致，12 h明顯低于LPS組，24 h繼續(xù)下降，五靈膠囊對LPS導(dǎo)致小鼠肝內(nèi)ALP下降無作用。見表1。表1 肝損傷小鼠不同時間血清酶的變化及五靈膠囊的作用（略）3.2 對LPS誘導(dǎo)肝內(nèi)MDA，TRIG，NOS含量影響小鼠iv LPS后3 h，與正常組比較，肝內(nèi)MDA含量升高，12 h顯著升高并達(dá)到高峰，24 h下降但明顯高于正常組(P<0.05)。小鼠LPS攻擊后3 h肝內(nèi)

13、TRIG含量無變化，6 h TRIG值上升(P<0.05)，12 h達(dá)到最高，24 h下降但仍明顯地高于正常組(P<0.05)。肝內(nèi)NOS在3 h上升，12 h達(dá)最高(P<0.05)，24 h降至正常。與模型組比較,五靈膠囊組各時間點(diǎn)MDA含量均明顯低于LPS組。對LPS誘導(dǎo)小鼠肝內(nèi)TRIG和NOS含量增加無降低作用,見表2。表2 LPS誘導(dǎo)肝內(nèi) MDA，TRIG，NOS水平變化及五靈膠囊的作用（略）3.3 對LPS誘導(dǎo)肝內(nèi)TNF-，CD14，iNOS，eNOS表達(dá)的影響免疫組化染色結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織表達(dá)微量的TNF-，CD14，iNOS，eNO

14、S，在不同的時間段內(nèi)陽性表達(dá)率大致恒定。與正常組比較，小鼠iv LPS后不同時間點(diǎn)肝組織內(nèi)TNF-陽性表達(dá)率持續(xù)急劇升高(P<0.05)；CD14在3 h陽性表達(dá)率最高，6 h有所下降，12 h和24 h又顯著升高(P<0.05)；iNOS，eNOS陽性表達(dá)率高于正常值3倍，6 h和12 h下降，24 h顯著升高。五靈膠囊在12，24 h可明顯地降低TNF-， CD14，iNOS，eNOS陽性表達(dá)率。見表3。表3 LPS誘導(dǎo)肝內(nèi)TNF-，CD14，iNOS，eNOS陽性表達(dá)的變化及五靈膠囊的作用（略）4 討論 以往研究顯示LPS致肝損傷機(jī)制主要是通過激活 KC釋放T

15、NF-，IL-1，IL-8，PAF等細(xì)胞因子和介質(zhì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損害，同時也引起肝細(xì)胞各種代謝功能改變。有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射LPS后肝細(xì)胞蛋白合成、糖代謝均受影響，最終可導(dǎo)致動物死亡。本試驗(yàn)顯示小鼠iv LPS后3h，ALT和AST水平明顯升高并持續(xù)至12，24 h下降但仍顯著高于正常，ALP值則與前二者相反而明顯地降低，隨著時間的推移而逐漸降低，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重ALP值就愈低。小鼠iv LPS后3h肝內(nèi)MDA，NOS和TRIG值升高并不顯著，6、12 h 3指標(biāo)含量明顯增加，24 h MDA和TRIG值仍高于正常組，NOS下降至正常。小鼠iv LPS 3h血清酶ALT與AST明顯升高，表明肝細(xì)胞損傷

16、開始，肝內(nèi)MDA、NOS和TRIG并未急劇升高，提示在3h內(nèi)反應(yīng)肝損傷血清酶水平的上升與三介質(zhì)無關(guān)；在6，12，24 h肝內(nèi)MDA 、NOS 與TRIG值明顯增加，血清ALT與AST水平也顯著升高，肝內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，提示在此時三者參與肝損傷。卞建明等4發(fā)現(xiàn)TNF-對肝細(xì)胞DNA的代謝呈雙相調(diào)節(jié)，低濃度TNF-有刺激DNA合成的作用，而高濃度的TNF不但使DNA合成受阻，還造成肝細(xì)胞損傷，TNF-可通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物而使肝細(xì)胞能量代謝障礙5。CD14是KC表面存在的受體，在LPB存在下CD14與LPS結(jié)合并迅速與細(xì)胞膜上其他具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的LPS相關(guān)受體如TLR2，2整合素、L-sel

17、ectin等結(jié)合形成復(fù)合物，將LPS轉(zhuǎn)遞給這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子介導(dǎo)KC激活分泌炎性細(xì)胞因子。誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS）在生理情況下表達(dá)微量，只有在LPS和某些因子誘導(dǎo)下肝實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞才大量生成，從而產(chǎn)生持久的生理效應(yīng)6。本實(shí)驗(yàn)顯示組織中TNF- ，CD14，iNOS，eNOS 陽性表達(dá)率在324 h持續(xù)高表達(dá)，與肝功酶水平波動一致，肝組織iNOS、eNOS陽性表達(dá)率與肝內(nèi)總NOS的結(jié)果趨向一致。提示這些因子與介質(zhì)參與了肝損傷過程。五靈膠囊對3 h肝功酶酶水平無作用，至6 h逐漸影響LPS所致小鼠肝損傷，各肝功酶酶水平下降，至12 h產(chǎn)生明顯的抑制作用，提示五靈膠囊并非直接作用血液內(nèi)肝功酶而使酶

18、水平下降，而是作用于LPS損傷肝細(xì)胞的某些環(huán)節(jié)而降低ALT和AST水平。ALP來自細(xì)胞器功能酶，五靈膠囊不能阻止ALP下降提示其對LPS所致細(xì)胞器損傷無作用。五靈膠囊在12，24h明顯降低MDA和NOS含量，TNF-、 CD14、iNOS、eNOS陽性表達(dá)率下降，同時AST、ALT酶水平也相應(yīng)下降，提示五靈膠囊抑制LPS所致肝損傷與降低炎性因子和介質(zhì)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠iv LPS后甘油三酯（TG）則急劇上升，TRIG升高可能是LPS導(dǎo)致清道夫受體下調(diào)，干擾血清脂蛋白在肝內(nèi)修飾，甘油三酯在肝內(nèi)代謝的改變導(dǎo)致血清中TRIG升高，另一種可能是LPS引起胰島素抵抗造成脂質(zhì)紊亂，五靈膠囊不能抑制LPS誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)TRIG升高，其原因有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1孫晶，李虹.慢性肝病患者血清細(xì)胞因子變化與臨床意義J.中國免疫學(xué)雜志，2000，16（7）：390.2張明森，王宇明，顧長海，等. 內(nèi)毒素