高效液相色譜精選干貨

1、高效液相色譜2020-12-242第一節(jié) 概述 優(yōu) 缺 lc 適用范圍廣 效率低 gc 高效、高速， 300多萬化合物中 高靈敏度、自動(dòng)化 僅20%能用gc hplc：由經(jīng)典液相色譜hplc有三個(gè)突破 1、：5m 10m 高效 （經(jīng)典lc75-590m） 2、高壓泵輸液高壓泵輸液： 高壓 3、高靈敏度的檢測器高靈敏度的檢測器： 儀器化2020-12-2432020-12-244 hplchplc特點(diǎn)特點(diǎn)： 1、適用范圍廣 2、高效 3、高速 4、高靈敏度（主要用uv 510-10g/ml） 5、流動(dòng)相選擇范圍寬 6、柱可以反復(fù)使用（可用1-2年） 7、流動(dòng)組分易收集 8、安全2020-12-2

2、45 第二節(jié) 基本原理 一、范氏方程：一、范氏方程： 1 1、柱內(nèi)展寬、柱內(nèi)展寬： h=a+b/+c (a渦流擴(kuò)散 b縱向擴(kuò)散 c傳質(zhì)阻抗) 在前述氣相gc中b=2rdm中dm比hplc中大105倍 在hplc中第二項(xiàng)可忽略，故高效液相色譜的范氏方程為： h = a + ch = a + c2020-12-246 h=a+ch=a+c 渦流擴(kuò)散項(xiàng)：a=2dp（-不規(guī)則因子 dp填充物直徑） 傳質(zhì)阻抗項(xiàng)引起板高：c=cm+csm+cs 由于目前大都使用數(shù)學(xué)鍵合相，以cs可忽略。 a、引起部分：hs= 忽略 cs常數(shù)與顆粒內(nèi)空隙體積分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。 dp填料直徑 ds組分在固定相中擴(kuò)散系數(shù)。

3、固定相的粒度dp對物質(zhì)抗項(xiàng)也有影響uddpcss212020-12-247 b 、 由 流 動(dòng) 相 引 起 部 分 ： hm= , hsm= , （hsm靜態(tài)流動(dòng)相物質(zhì)阻抗項(xiàng)） cm流動(dòng)相的物質(zhì)阻抗系數(shù)，與填充物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān) hplc的范氏方程： h=a+cu=2dp+（ ）u cs csm (1) dp，h，n (2) dm，流動(dòng)相粘度增大，h，n (3) 要使，h填充要均勻。uddpcmm22uddpcmm21msmssddpcddpc21212020-12-248 2 2、柱外展寬：、柱外展寬： 進(jìn)樣器聯(lián)結(jié)管邊等死體積越小越好。 hplc 2-6mm 10-30cm 死體積約1ml 記：由

4、h=a+c，在hplc中可近似認(rèn)為板高與速成正比（直線關(guān)系），h，n，為了兼顧柱效和分析速度，一般采用較低流速，多用1ml/min流量。2020-12-249 二、分離度及影響因素：二、分離度及影響因素： 又可： 討論如何由n、k 來改變r(jià) 1 1、 k， r ， k最適宜范圍1k52/2112wwttrrr22114kknr2020-12-2410 2 2、改變、改變變峰間距變峰間距 ，r在gc主要通過改變固定相（載量一定），而在hplc中，主要通過改變流動(dòng)相。 3 3、改變、改變n n、nn a、減小題粒直徑dp b、提高裝柱技術(shù)（均勻） c、流動(dòng)相（低粘度流動(dòng)相可以增大dm）（dm 組分

5、在流動(dòng)相速擴(kuò)散） d、線速度u（減小傳質(zhì)阻抗引起h） e、增加柱長l（但太長，柱壓大，壽命短）2020-12-2411第三節(jié) 各類hplc法 近年來新的hplc法應(yīng)運(yùn)而生 我們僅講其中部分內(nèi)容： hplc 高效液相 lsc 液固llc液液iec離子交換sec空間排阻ac親和色譜ce毛細(xì)管電泳bpc化學(xué)鍵合相npbc正rbpc反pic離子對isc離子抑制2020-12-2412 一、液一、液- -固吸附色譜：固吸附色譜：lsclsc 1 1、機(jī)理機(jī)理：同前章，即組分分子與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面的活性中心的能力不同而分離。通過ka不同來達(dá)到目的的。在吸附色譜中，常用容量因子來討論問題。 2 2、

6、影響、影響k k的因素的因素： 當(dāng)柱與柱溫（一般是室溫）選定時(shí)，k與溶質(zhì)與溶劑的性質(zhì)有關(guān)。以硅膠吸附劑為例。 與硅膠親和力大的溶質(zhì)k大，tr大 控制溶劑的極性，可調(diào)整tr(常用多元體系流動(dòng)相)溶劑 的極性愈大，洗脫力愈強(qiáng)，k .tr)2020-12-2413 二、液二、液- -液分配色譜：液分配色譜：llcllc 分離機(jī)理同前幾章：llc 與液相色譜同樣有正相色譜與反相色譜之分。 ( (一一). ). 正、反色譜正、反色譜 正相 反相 固定相極性 大 小 流動(dòng)相極性 小 大 流動(dòng)順序 極性小的組分先流出 極性大的組分先流出 2020-12-2414 反相主要用于分離非極性及中等極性各類分子型化

7、合物。 正相色譜正相色譜:固定相：氰基與氨基化學(xué)鍵合相 流動(dòng)相：與以硅膠為固定相的吸附色譜選法一致。 反相色譜反相色譜: :固定相如：十八烷基鍵合相（ods；orc18表示） 流動(dòng)相：甲醇-水or乙腈-水 ph2-8 反相色譜是應(yīng)用最廣的色譜法，主要用于分離非極性至中等極性的各類分子型化合物。2020-12-2415 三、反相離子對色譜：（三、反相離子對色譜：（rpicrpic） 把離子對試劑加入極性流動(dòng)相中，被分析的離子在流動(dòng)相中與離子對試劑（反離子）生成不帶電荷的中性離子時(shí)，從而增加在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增大，而改變分離效果。 由上分離原理可以看出，反離子對色譜并不難實(shí)現(xiàn)，只

8、是在前邊所講的反相色譜的流動(dòng)相中，加進(jìn)離子對試劑，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒h即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2020-12-2416 1 1、常用離子對試劑：、常用離子對試劑： 分析樣品 離子對試劑 例 堿 烷基磺酸鈉 c5、c6、c7、c8磺酸鈉 酸四丁基季銨鹽 四丁基胺磷酸鹽（tba） 2 2、機(jī)理、機(jī)理： 流動(dòng)相 固定相 b+h+ bh+ + rso3na rso-3+na+ bh+. .rso-3 bh+. .rso-3 中性離子對 增 加 了 在 非極性固定相中溶解度。2020-12-2417 3 3、分配系數(shù)、分配系數(shù)：其流出順序與反相液相色譜一致。 分離堿（rnh2），流動(dòng)相ph33.5k= 分離酸（rcoo

9、h） ph7.5 k= 注注：凡在反相色譜中影響k的因素，此處同樣。 離子對試劑c鏈，k，k。 此離子對色譜在藥物分析中對有機(jī)酸、生物堿及抗生素應(yīng)用較廣。但有試劑價(jià)格貴，且流動(dòng)相因有一定ph，對泵和流路有腐蝕。mspicbrnhpicbrnh33mspicaircoopicarcoo2020-12-2418 四、離子抑制色譜四、離子抑制色譜iscisc 在前邊所述的反相色譜法中，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的ph，抑制組分離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸，弱堿的目的。 1 1、適用范圍、適用范圍：3.0pka7.0 的弱酸 7.0pka8.0 的弱堿 而pka8的堿應(yīng)用離子對色譜。 pka8

10、pkbph-pka 2 2、抑制劑、抑制劑 弱酸（hac）、弱堿（nh3h2o）或緩沖液2020-12-2419 3 3、k k及其影響因素：及其影響因素： (1)凡在反向色譜中的影響因素，此處同樣影響。 (2)ph的影響 弱酸：phpka時(shí)，k,tr(以離子形式為主，流動(dòng)相中多) 弱堿與上恰相反。phpkb tr 總之，ph應(yīng)在28，超出將會(huì)腐蝕儀器，流路系統(tǒng)。2020-12-2420 4 4、用途：、用途： （1）有機(jī)弱酸或弱堿與兩性化合物的分離。 （2）有機(jī)弱酸或弱堿與分子型化合物的分離。 注意：對于pka8的堿不能用此色譜。2020-12-2421第四節(jié) 固定相 一、一、l ls s色

11、譜色譜 1.1.硅膠：硅膠： （1）表孔硅膠：（薄殼玻球ybk） 特點(diǎn)：易裝柱，但柱效不高，柱容量?。?0005000） （2）無定形全多孔硅膠：ywg、510m 特點(diǎn)：柱效高，柱容量大，但要?jiǎng)驖{裝柱。價(jià)格便宜 （80000100000） （3）球形全多孔硅膠：yqg 310m 特點(diǎn)：除具有ywg的優(yōu)點(diǎn)外，還具渦流擴(kuò)散項(xiàng)小及滲透 性好等特點(diǎn)。 （4）堆積硅珠：sio2溶膠+凝膠劑聚結(jié)而成。35m 特點(diǎn)：傳質(zhì)阻抗小，柱容量大（80000）2020-12-2422 特點(diǎn) 表孔硅膠(ybk) 易裝柱，柱效不高，柱容量小 （10005000） 無定形全多孔硅膠（ywg） 柱效高，柱容量大，價(jià)廉，但 硅

12、膠 要?jiǎng)驖{8000-100000） 球形全多孔硅膠（yqg） 具ywg的優(yōu)，具渦流擴(kuò)散小， 滲透性好 堆積硅珠 傳質(zhì)阻抗小，柱容量大 （800000）2020-12-2423 2 2、高分子多孔小球、高分子多孔小球：ysg （柱效低103） 又稱有機(jī)膠：苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成。 用途：分離芳烴、雜環(huán)、甾體、生物堿 二、二、l ll l色譜固定相：載體色譜固定相：載體+ +固定液固定液 （一）機(jī)械涂漬（現(xiàn)高效中基本淘汰）（一）機(jī)械涂漬（現(xiàn)高效中基本淘汰） （二）化學(xué)鍵合相：（二）化學(xué)鍵合相： 采用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液結(jié)合在擔(dān)體上。具有吸附與分配雙重作用。 優(yōu)點(diǎn)：不流失，穩(wěn)定（ph28液中不變

13、質(zhì)），熱穩(wěn)定性好，且能用于梯度洗脫。2020-12-2424 非極性鍵合相：鍵合非極性基團(tuán)：ods（十八烷基） 化學(xué)鍵合相 中等極性鍵合相：醚基鍵合相（正反應(yīng)用流動(dòng)相極性反應(yīng)） 極性鍵合相：鍵合極性基團(tuán)（氨基、氯基） 1 1、非極性鍵合相、非極性鍵合相：鍵合相表面基團(tuán)為非極性基團(tuán)。 常用：ods鍵合相（十八烷基鍵合相） 載體：全多孔ywg，yqg、堆積硅球，作為ods鍵合 相與載體。 國產(chǎn)如：ywg-c18（5，10m）， ywg-c6（5，10m） 表面覆蓋度： 參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例為表面覆蓋度。其覆蓋度的大小，決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)作用。 鍵合基團(tuán)鍵長：，

14、載樣量，k2020-12-2425 2 2、中等極性鍵合相、中等極性鍵合相：醚基鍵合相（正、反色譜由流動(dòng)相 極性而定） 3 3、極性鍵合相、極性鍵合相：鍵合極性基團(tuán)（氨基、氰基） 國產(chǎn)品：ywg-nh2，ywg-cn（5，10m） ( (三三) )離子交換劑離子交換劑 經(jīng)典液相色譜的交換樹脂，不耐壓，不適用，此處用離子鍵合相。 載體：薄殼型或全多孔微粒硅膠。 離子交換基團(tuán)：-so3h，-nr3cl等 -so3h強(qiáng)酸型 -nr3cl強(qiáng)堿型2020-12-2426 注意：在ph08的流動(dòng)相時(shí)使用，且要控制一定的離子強(qiáng)度。當(dāng)色譜條件一定時(shí)，柱交換容量大，保留時(shí)間長。 當(dāng)色譜條件一定時(shí)，柱交換容量大，

15、保留時(shí)間長。 （四）凝膠：（空間排斥色譜）（四）凝膠：（空間排斥色譜） 具有一定孔徑的多孔性凝膠。2020-12-2427 2020-12-2428第五節(jié) 流動(dòng)相在hplc中，溶劑不同，與分子間作用力不同，有可能使組分的r不同，改變?nèi)軇┑臉O性，對組分的洗脫能力改變，tr改變，實(shí)驗(yàn)時(shí)可適當(dāng)配比，以至得到較適宜的r。 對流動(dòng)相的要求： 1 1、不與固定相反應(yīng)不與固定相反應(yīng) 2 2、對樣品的溶解度適當(dāng)、對樣品的溶解度適當(dāng)（控制r25） 3 3、與檢測器匹配與檢測器匹配 4 4、粘度小、粘度小 優(yōu)化及選擇自學(xué)（不要求）。)1)(1(422kkr2020-12-2429第六節(jié) 儀器 輸液泵進(jìn)樣器色譜柱檢

16、測器記錄 一、輸液泵：一、輸液泵： 往復(fù)泵往復(fù)泵 2020-12-2430 二、色譜柱與進(jìn)樣器二、色譜柱與進(jìn)樣器： 1 1、進(jìn)樣器：、進(jìn)樣器：早期用隔膜進(jìn)樣閥，帶壓進(jìn)樣，操作困難，進(jìn)樣器易反彈出而損壞。 六通閥： 優(yōu)勢：進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可帶壓進(jìn)樣。2020-12-2431 2. 2.色譜柱：色譜柱： 由柱管和固定相組成。 柱管柱管：不銹鋼管 2-5mm l1030cm 常量柱 11.5mm l1020cm 常微量柱 裝柱裝柱是一項(xiàng)技巧性很強(qiáng)的技術(shù)，它直接影響柱效。當(dāng)填料20m，較易裝，干法，輕叩。粒度20m，勻漿裝柱。（先將填料用等密度的有機(jī)溶劑勻漿，再高壓裝柱。無論裝柱還是買柱，要進(jìn)行

17、柱效檢查。測度條件根據(jù)柱類型不同而選用不同的檢測。 測出各組分的w，tr，求出n和r1.52020-12-2432 uv 70% 三、檢測器三、檢測器 熒光 多用 15% 示差分析 電化學(xué) 蒸發(fā)光散射檢測器 （一）紫外檢測器（一）紫外檢測器： 優(yōu)：靈敏度高，精密度、線性范圍好，可用于梯度洗脫。 缺：樣品組分應(yīng)吸收紫外光 要考慮溶劑的極限波長2020-12-2433 1 1、固定波長型：、固定波長型： 光源：254nm低壓汞燈，此類檢測器光源強(qiáng)度大，靈敏度高，檢測限可達(dá)110-9g/ml，是一種簡便實(shí)用的檢測器。 2 2、可變波長檢測器、可變波長檢測器 可選擇max（類似于可見紫外分光光度計(jì)），

18、將波長調(diào)在最大的max處進(jìn)行檢測，以增加靈敏度。（有些配置較好的還可同時(shí)掃出紫外光譜），現(xiàn)多數(shù)hplc配這種檢測器。2020-12-2434 3 3、光電二極管陳列檢測器：、光電二極管陳列檢測器： 通過吸收池的光經(jīng)光柵分光200-699nm，分光的光進(jìn)入由500個(gè)單元組成的光電二極管陳列上。可同時(shí)測每隔1nm的光線，因此uv（200380nm）及vis（381699nm）的譜線瞬間（約60msec）就可測出。信號經(jīng)處理后記錄儀打出三維空間圖，或是平均吸光度色譜圖。 優(yōu)：可鑒別重疊峰，確認(rèn)峰純度，比較各峰化學(xué)結(jié)構(gòu)，并可從幾個(gè)通道同時(shí)進(jìn)行峰面積計(jì)算，提供最佳定量標(biāo)準(zhǔn)。2020-12-2435202

19、0-12-2436 （二）其它檢測器（二）其它檢測器 1 1、熒光檢測器：、熒光檢測器： 樣品應(yīng)有熒光，靈敏度比紫外更高。檢測限110-10g/ml 2 2、示差檢測器：示差檢測器： 利用組分與流動(dòng)相的折射率之差，類似氣相熱導(dǎo)、利用組分與載氣熱導(dǎo)率不同，進(jìn)行檢測。 缺：對多數(shù)物質(zhì)檢測限較低。環(huán)境、溫度對其均有影響。 3 3、電化學(xué)檢測器：、電化學(xué)檢測器： 利用組分氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流或電壓變化進(jìn)行檢測。對還原性物質(zhì)檢測限110-12g/ml。缺：不能測不能氧化還原的物質(zhì)。2020-12-2437第七節(jié) 定性、定量分析 一、定性分析：一、定性分析： 1 1、t tr r: :12 12 相對保留值相對保留值= 2 2、化學(xué)鑒定、化學(xué)鑒定：對hplc流出組分收集，用專屬性化學(xué)反應(yīng)對收集的分離物質(zhì)組分進(jìn)行定性。 3 3、聯(lián)機(jī)技術(shù)、聯(lián)機(jī)技術(shù)： hplcms、 hplcftir 質(zhì)譜 富利葉轉(zhuǎn)換紅外光譜2121kkt