流式細(xì)胞術(shù)檢測人和小鼠細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子方法的建立

1、流式細(xì)胞術(shù)檢測人和小鼠th細(xì)胞亞群早在1986年mosmann等1依據(jù)小鼠分泌的細(xì)胞因子譜不同首次將th細(xì)胞分為th1和th2兩個功能不同的獨(dú)立亞群。th1細(xì)胞主要分泌il-2、il-12、ifn-和tnf- 等細(xì)胞因子，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)。th2細(xì)胞主要分泌il-4、il-5、 il-6、il-10和il13等細(xì)胞因子，其主要功能為刺激b細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。由于th1/th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，th1/th2 平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身

2、免疫性疾病、過敏性疾病以及移植排斥反應(yīng)等都與th1/th2 平衡有關(guān)。因此建立穩(wěn)定有效的細(xì)胞內(nèi)因子檢測方法對于準(zhǔn)確說明th1/th2細(xì)胞的作用非常重要。目前檢測的主要方法有酶聯(lián)免疫法、elispot法、熒光定量法及原位雜交等方法。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子是一種相對快速、重復(fù)性好并能準(zhǔn)確定量的方法。我們參照國內(nèi)外的一些文獻(xiàn)，對于人和小鼠th1和th2細(xì)胞的流式檢測方法進(jìn)行了探索，并比較了兩者之間的不同。由于未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少，用流式細(xì)胞儀很難檢測出來，因此在檢測前需刺激活化。目前國內(nèi)外推薦的刺激物主要為pma （佛波酯）和離子霉素（ionomycin）。 淋巴細(xì)胞在刺激物的作用

3、下活化，分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外。由于流式細(xì)胞儀只能對細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測，因此必須阻止細(xì)胞因子的分泌。抑制細(xì)胞因子分泌的試劑為brefedlin a 或莫能霉素（monensin）。th1/th2 細(xì)胞首先是cd4+ t淋巴細(xì)胞。因此如何確定cd4+ t淋巴細(xì)胞非常重要，我們主要圍繞該問題進(jìn)行探討。材料與方法試劑pma（sigma）貯存液：pma 溶于dmso 濃度為0.1mg/ml -20 保存。工作液：貯存液1:100 稀釋于rpmi 1640培養(yǎng)基中，此時為1µg/ml。ionomycin（sigma）貯存液：ionomycin 溶于dmso 濃度為1mg/ml -20

4、保存。工作液：貯存液1:20 稀釋于rpmi 1640 培養(yǎng)基中，此時為50µg/ml。golgistop（內(nèi)含monensin ，bd pharmingen）cytofix/cytoperm液、perm/wash液和facs lysing solution，均購自bd pharmingen。抗體細(xì)胞表面標(biāo)記抗體：抗人cd3-apc，cd8-percp，cd8-cyc，cd4-cyc。抗小鼠cd4-cyc、cd8pe。細(xì)胞內(nèi)因子抗體：抗人il-4-pe, ifn-fitc?？故骾l-4-pe, ifn-fitc。以上抗體均購自bd pharmingen。實驗方法1 外周血單個核細(xì)胞的

5、分離：取肝素抗凝正常人或者balb/c小鼠外周血1.5ml。在試管內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液3ml。將外周血以等體積hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液上層。2000g離心20min。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個核細(xì)胞，加入hanks液3ml，混勻后，1500g離心5min。棄去上清，細(xì)胞加入0.5ml rpmi 1640培養(yǎng)基（含10% 小牛血清，50 g/ml penicillin 和50g/ml steptomycin）重懸，血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。2 不同濃度的pma刺激后人t淋巴細(xì)胞cd4、cd8和cd3的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5×105個細(xì)胞，

6、加入rpmi 1640培養(yǎng)基至總體積1ml。加入不同濃度的pma（10ng、20ng和50ng終濃度）和500ng/ml ionomycin共同刺激人外周血單個核細(xì)胞，同時加入0.7µl golgistop，37 co2孵箱刺激4h。收集單個核細(xì)胞，分為三部分，分別加入cd8-cyc、cd4-cyc、cd3-apc單抗各10ul，室溫避光孵育30min。加入紅細(xì)胞裂解液（facs lysing solution）1ml裂解殘余紅細(xì)胞，2ml pbs洗滌細(xì)胞一次。流式細(xì)胞儀（facscalibur，becton dickinson)檢測細(xì)胞，cellquest軟件獲取分析細(xì)胞，每個檢測

7、獲取10000個細(xì)胞。采用前向角（fsc）和側(cè)向角（ssc）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以直方圖分別表示cd3、cd8和cd4陽性淋巴細(xì)胞。3 不同時間pma和離子霉素刺激后小鼠t淋巴細(xì)胞cd4和cd8的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5×105個細(xì)胞，加入rpmi 1640培養(yǎng)基至總體積1ml。加入pma和ionomycin使終濃度分別為100ng/ml和1µg/ml，同時加入0.7µl golgistop。37 co2孵箱刺激8h、12h分別收集細(xì)胞。采用抗小鼠cd4-cyc、cd8pe抗體標(biāo)記t淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測cd4和cd8的表達(dá)。4 流式細(xì)胞

8、術(shù)檢測人外周血th1和th2細(xì)胞。分離外周血單個核細(xì)胞，加入20ng/ml pma和500ng/ml 離子霉素刺激4h后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，分別加入cd3-apc，cd8-percp10µl，混勻，室溫放置20min，加入紅細(xì)胞裂解液1ml，混勻，室溫放置10min，1000g離心5min，棄上清。加入cytofix/cytoperm液200µl，4放置20min， 使細(xì)胞固定穿孔。加入perm/wash液1ml，1500g離心5min，棄上清。實驗管加入ifn-fitc、il-4 - pe各5ul，對照管加入同型對照抗體，4避光孵育30min。

9、加入perm/wash液500µl洗滌兩次。最后以300µl洗滌液重懸細(xì)胞。采用facscom軟件及cd3-apc、cd8-percp 、ifn-fitc、il-4 pe抗體單雙標(biāo)記的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角（fsc）和側(cè)向角（ssc）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以cd3和cd8散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分th細(xì)胞（cd3+cd8-）。最終以ifn-和il-4的散點(diǎn)圖表示th1細(xì)胞和th2細(xì)胞。5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血th1和th2細(xì)胞。分離外周血單個核細(xì)胞，加入100ng/ml pma和1µg/ml 離子霉素刺激5h后，收

10、集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，加入cd4cyc 10µl，混勻，其余步驟同人的檢測。調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角（fsc）和側(cè)向角（ssc）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以cd4直方圖設(shè)門區(qū)分th細(xì)胞（cd4+），以ifn-和il-4的散點(diǎn)圖表示th1細(xì)胞和th2細(xì)胞。結(jié)果1 不同濃度的pma對人外周血t淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。10ng、20ng和50ng的pma刺激后4h，cd4的表達(dá)明顯下降，已經(jīng)不能區(qū)分出cd4陽性t淋巴細(xì)胞，而cd8和cd3的表達(dá)未受明顯影響。重復(fù)5次檢測，典型的檢測結(jié)果見圖1。2 不同時間的pma刺激對小鼠外

11、周血t淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。pma刺激8h后cd4陽性t淋巴細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯下降。pma刺激12h后，cd4陽性t淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯下降。而cd8表達(dá)在8h和12h均沒有明顯下降。典型的檢測結(jié)果見圖2。3 正常人外周血th1細(xì)胞和th2細(xì)胞。采用cd3+cd8-的t淋巴細(xì)胞為th細(xì)胞，設(shè)門分析th1細(xì)胞（ifn-+）和th2細(xì)胞（il-4+）的百分比。典型檢測結(jié)果見圖3。4 正常balb/c小鼠外周血th1細(xì)胞和th2細(xì)胞。采用cd4淋巴細(xì)胞為th細(xì)胞，設(shè)門分析th1細(xì)胞（ifn-+）和th2細(xì)胞的百分比（il-4+）。典型檢測結(jié)果見圖4。討論從rostaing等2發(fā)表流式細(xì)胞術(shù)檢細(xì)胞內(nèi)細(xì)

12、胞因子的方法后，陸續(xù)有人研究了流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子方法的可行性及重復(fù)性等問題。雖然活化t淋巴細(xì)胞有各種各樣的方法，如：pma、pha、con a、cd3、cd2和cd28等。但是目前公認(rèn)的較好的方法仍然是pma和鈣離子載體的聯(lián)合刺激。研究發(fā)現(xiàn)在pma的刺激后4h，ifn-和il-4的表達(dá)就達(dá)到一個較高的水平，因而適合進(jìn)行流式檢測。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人的外周血t淋巴細(xì)胞表面的cd4表達(dá)受pma的影響非常大，在刺激后2h即明顯下降，4h已經(jīng)難于區(qū)分cd4陽性t淋巴細(xì)胞，因此這就難于確定th細(xì)胞。雖然國內(nèi)部分學(xué)者認(rèn)為在pma的刺激下，cd4仍可以維持一定的表達(dá)3,4，但是我們的結(jié)果和國內(nèi)部分5

13、及國外的大多數(shù)2,6研究結(jié)果表明，在pma的刺激下，cd4表達(dá)迅速下調(diào)，此時采用cd4來標(biāo)記th細(xì)胞已經(jīng)不能準(zhǔn)確的檢測th細(xì)胞，因而不能準(zhǔn)確的反應(yīng)th1和th2細(xì)胞的比率。而cd3和cd8的表達(dá)受pma等刺激因子的影響很小，因此，目前，國外推薦的方法是采用cd3和cd8設(shè)門，區(qū)分cd4陽性t淋巴細(xì)胞。由于多色熒光標(biāo)記流式檢測技術(shù)的發(fā)展，筆者認(rèn)為采用4色標(biāo)記技術(shù)檢測人th細(xì)胞是目前最好的方法。這種方法可以實現(xiàn)一個檢測管，同時觀察th1細(xì)胞和th2細(xì)胞；可以檢測cd8細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因子的表達(dá)；還可以觀察il-4和ifn-雙陽性細(xì)胞。一個檢測管同時染色，節(jié)約了抗體和勞動量等檢測成本。但是由于多色染色技

14、術(shù)對流式的操作者有較高的要求，實施過程要注意補(bǔ)償調(diào)節(jié)等具體問題，我們曾經(jīng)采用cyc標(biāo)記的cd8和apc標(biāo)記的cd3聯(lián)合設(shè)門區(qū)分th細(xì)胞，由于cyc和apc在bd公司的流式細(xì)胞儀上，儀器的補(bǔ)償調(diào)節(jié)非常困難，最終放棄該方法，改用percp標(biāo)記的cd8才解決這一問題。目前，國內(nèi)一些流式細(xì)胞儀型號相對落后，不能進(jìn)行4色染色標(biāo)記技術(shù)，筆者認(rèn)為可以采用雙管標(biāo)記檢測法，即采用cd3、cd8和ifn-3色標(biāo)記一管用于檢測th1細(xì)胞；采用cd3、cd8和il-4 3色標(biāo)記一管用于檢測th2細(xì)胞。采用這種方法的缺陷是每個樣品檢測管數(shù)增加，造成檢測成本增高，而且不能同時觀察il4和ifn-雙陽性細(xì)胞。國外有報道采用

15、ifn-、il-4和cd3進(jìn)行3色標(biāo)記7，這種方法只能觀察t淋巴細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子的變化，不能區(qū)分cd4和cd8細(xì)胞，筆者認(rèn)為是一種不可取的方法。我們在balb/c小鼠實驗發(fā)現(xiàn)在pma的刺激下，cd4表達(dá)雖然下調(diào)，但是其表達(dá)持續(xù)時間比人的持續(xù)時間明顯增長，在刺激8h后，仍然能維持一個較高的水平，因而能夠有效的區(qū)分th細(xì)胞。因此，在balb/c小鼠采用cd4和ifn-、il-4進(jìn)行3色標(biāo)記技術(shù)就能有效的檢測th細(xì)胞亞群。當(dāng)然由于cd3和cd8的表達(dá)受pma的影響很小，采用cd3、cd8和ifn-、il-4進(jìn)行4色標(biāo)記技術(shù)也非常有效。另外，由于cd4不僅在t細(xì)胞上表達(dá)，還在單核細(xì)胞上表達(dá)，單獨(dú)用c

16、d4設(shè)門容易受單核細(xì)胞的干擾，解決這個問題的一個辦法就是采用fsc和ssc散點(diǎn)圖來設(shè)門區(qū)分單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，采用cd4直方圖區(qū)分cd4陰性和陽性細(xì)胞，最后采用既位于淋巴細(xì)胞區(qū)，有位于cd4區(qū)的細(xì)胞來定義為th細(xì)胞，這樣可以有效的避免單核細(xì)胞的干擾。當(dāng)然采用4色標(biāo)記也是一種非常有效的避免單核細(xì)胞干擾的方法。由于t淋巴細(xì)胞表達(dá)的因子非常多，檢測其它細(xì)胞因子可以參照檢測il-4和ifn-的方法進(jìn)行。凡是采用pma等作為刺激劑的檢測方法均應(yīng)考慮到pma等刺激劑對于細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響，從而選擇最佳的熒光抗體標(biāo)記，這是進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1. mosmann tr, cherwinski

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