口蹄疫液相阻斷ELISA

1、A型口蹄疫液相阻斷ELISA2015年12月一、液相阻斷ELISA基礎(chǔ)知識(shí)n液相阻斷ELISA（LB-ELISA）通途：n1、檢測(cè)口蹄疫感染，廣泛用于國際貿(mào)易中，是OIE指定方法之一；n2、監(jiān)測(cè)牛、羊和豬等偶蹄動(dòng)物血清中口蹄疫免疫效價(jià)，評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗免疫效果。BL-ELISA原理圖原理圖待檢血清與病待檢血清與病毒抗原混合液毒抗原混合液捕獲抗體捕獲抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體病毒酶結(jié)合物病毒酶結(jié)合物顯色液顯色液陽性不顯色陽性不顯色陰性顯黃色陰性顯黃色nBL-ELISA反應(yīng)原理：n將預(yù)先滴定好的病毒抗原與被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后將抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫特異性抗體的ELISA板中，沒有完全被

2、血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲，再通過酶結(jié)合物與底物顯色。按照實(shí)驗(yàn)孔呈現(xiàn)顏色與抗原對(duì)照（未加血清）孔呈現(xiàn)顏色相比較判定結(jié)果。n抗體滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示。二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備n1、使用前，試劑盒所有組份應(yīng)回復(fù)到18-26，試劑要混合均勻，每個(gè)樣品使用一個(gè)吸頭。n2、濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋。三、實(shí)驗(yàn)操作步驟三、實(shí)驗(yàn)操作步驟n1、抗原抗體反應(yīng)布板圖圖 2 96 孔酶標(biāo)板檢測(cè)孔酶標(biāo)板檢測(cè) 20 份樣品布局圖份樣品布局圖S1 1:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561

3、:256S1 1:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512病毒抗原1:641:10241:1281:20481:2561:4096n1.1稀釋病毒抗原：用配制好的洗滌液在孔外6倍稀釋病毒抗原。n1.2待檢血清稀釋：在血清稀釋板上，使用洗滌液連續(xù)2倍稀釋每份被檢血清，每份血清稀釋2-8孔，根據(jù)檢測(cè)用途而定。使每孔最終量都為50vl。n1.3稀釋陽性對(duì)照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：16-1：1024。n1.4稀釋陰性對(duì)照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：2-1：4。n1.5血清稀釋板加樣：使用稀釋好的病毒抗原加樣，其中預(yù)設(shè)的4孔病毒抗原對(duì)照孔按100vl/

4、孔加入，其余待檢血清、陰陽性對(duì)照按50vl/孔加入。加樣完畢，所有樣品孔和因陽性對(duì)照孔稀釋度翻倍，變?yōu)閳D1圖、2所示。n1.6將加好樣的血清稀釋板封板，置于37反應(yīng)2h。n2、樣抗原抗體混合液及病毒抗原對(duì)照從血清稀釋板上按次序轉(zhuǎn)移到包被板上50vl/孔，封板， 37反應(yīng)30Min。n3、洗滌液洗版5次，拍干。加抗體溶液 50vl/孔，封板， 37反應(yīng)35Min。n4、同上洗板5次，拍干。加酶結(jié)合物50vl/孔，封板， 37反應(yīng)35Min。n5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底物溶液（顯色液A和B按1：1混合），37 避光溫育15min。n6每孔再加50vl終止液終止反應(yīng)，立即在450n

5、m波長下讀取OD值。四、結(jié)果分析四、結(jié)果分析n1、實(shí)驗(yàn)成立條件n病毒抗原對(duì)照OD值應(yīng)在2.01范圍內(nèi)。n陽性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在1：10241滴度范圍內(nèi)。n陰性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)1：8.n如果實(shí)驗(yàn)無效，實(shí)驗(yàn)中的操作值得懷疑，最好重新作一遍。n2、結(jié)果判定n抗原對(duì)照4孔，棄去1個(gè)最高和最低值，計(jì)算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%對(duì)照值，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對(duì)照OD450值。n備檢血清OD450值臨界值，判為陰性；n備檢血清OD450值臨界值，判為陽性；n每份血清系列滴度稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該備檢血清的抗體效價(jià)。n若臨界值處于2孔之間，抗體效價(jià)取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍

6、數(shù)的反對(duì)數(shù)中間值，如果處在1：64和1:128之間，則該份血清抗體效價(jià)是1：90。n定性檢測(cè)時(shí)，兩個(gè)孔只有一個(gè)孔為陽性，則抗體滴度為1：128，2孔均為陽性，則抗體效價(jià)1：128.n抗體效價(jià)1：128，判為陽性；n抗體效價(jià)1：64，判為陰性；n抗體效價(jià)在1：64- 1：128之間，判為可疑；可以血清需要復(fù)檢，復(fù)檢抗體效價(jià)1：128，判為陽性；抗體效價(jià)1：64，判為陰性；五、注意事項(xiàng)n1、實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真閱讀說明書。n2、試劑盒所有濃縮試劑在低溫放置下，可能有無機(jī)鹽結(jié)晶，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，80溫育30min可溶解，且不影響實(shí)驗(yàn)。n3、所有試劑必須回復(fù)室溫使用，以免影響抗原抗體反應(yīng)n4、溫育設(shè)備要精確度要高，溫度過高過低都會(huì)影響OD值高低。n5、包被板反應(yīng)時(shí)嚴(yán)禁堆疊放置，應(yīng)平鋪且板間有間隙，切不可離箱壁太近。n6、所用移液器和設(shè)備要精準(zhǔn)。n7、備檢樣品要合格。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn)n嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)