第三章 分子熒光光度法

1、第三章第三章 分子熒光光度法分子熒光光度法3-1 3-1 分子熒光概述分子熒光概述分子熒光法的分分子熒光法的分析一般都在溶液析一般都在溶液中進(jìn)行，如前所中進(jìn)行，如前所述每個(gè)分子都具述每個(gè)分子都具有一系列嚴(yán)格的有一系列嚴(yán)格的分立能級(jí)分立能級(jí)：圖中圖中S S0 0表示分子表示分子的基態(tài)，的基態(tài)，S S1 1、S S2 2分分別為第一激發(fā)單別為第一激發(fā)單重態(tài)和第二激發(fā)重態(tài)和第二激發(fā)單重態(tài)；單重態(tài)；T T為激發(fā)為激發(fā)三重態(tài)；基態(tài)和三重態(tài)；基態(tài)和激發(fā)態(tài)都存在幾激發(fā)態(tài)都存在幾個(gè)不同的振動(dòng)能個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)。級(jí)。P.82P.82 物質(zhì)吸收了電磁輻射并發(fā)射出熒光的過程中物質(zhì)吸收了電磁輻射并發(fā)射出熒光的過程中大

2、致會(huì)經(jīng)歷以下幾個(gè)過程：大致會(huì)經(jīng)歷以下幾個(gè)過程：1.1.激發(fā)：激發(fā)： 通常在室溫下，大部分分子處于基態(tài)的最通常在室溫下，大部分分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，含有偶數(shù)個(gè)電子且自旋配對，處低振動(dòng)能級(jí)，含有偶數(shù)個(gè)電子且自旋配對，處于基態(tài)單重態(tài)于基態(tài)單重態(tài)(sinlet state(sinlet state；PauliPauli原理原理) )；當(dāng)；當(dāng)其吸收一定頻率的電磁輻射其吸收一定頻率的電磁輻射( (光量子光量子) )后電子可后電子可發(fā)生能級(jí)躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)發(fā)生能級(jí)躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)(S(S1 1) )，這一過程，這一過程稱為激發(fā)。稱為激發(fā)。2.2.去活化過程：去活化過程： 處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)

3、定的，可通過幾處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，可通過幾種不同的途徑回到基態(tài)，這一過程稱為去活化。種不同的途徑回到基態(tài)，這一過程稱為去活化。去活化過程主要有以下幾種：去活化過程主要有以下幾種：(1)(1)振動(dòng)馳豫：振動(dòng)馳豫： 溶液中分子之間通過碰撞，受激溶質(zhì)分子溶液中分子之間通過碰撞，受激溶質(zhì)分子向溶劑分子轉(zhuǎn)移過剩的向溶劑分子轉(zhuǎn)移過剩的振動(dòng)能量振動(dòng)能量，以，以1010-13-131010-11-11秒的速度，通過非輻射躍遷而降至同一電子能秒的速度，通過非輻射躍遷而降至同一電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)。這一過程稱為振動(dòng)馳豫。級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)。這一過程稱為振動(dòng)馳豫。(2)(2)熒光發(fā)射：熒光發(fā)射： 處于第一激

4、發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子，處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子，有幾種可能的去活化過程發(fā)生，其中之一是以有幾種可能的去活化過程發(fā)生，其中之一是以1010-9-91010-7-7秒左右的時(shí)間內(nèi)發(fā)射光量子回到基態(tài)的秒左右的時(shí)間內(nèi)發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，這一過程稱為熒光發(fā)射。各振動(dòng)能級(jí)，這一過程稱為熒光發(fā)射。(3)(3)內(nèi)轉(zhuǎn)移：內(nèi)轉(zhuǎn)移： 激發(fā)態(tài)分子從較高的電子能級(jí)轉(zhuǎn)換至較低的激發(fā)態(tài)分子從較高的電子能級(jí)轉(zhuǎn)換至較低的電子能級(jí)。電子能級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)移過程的速度很大程度上決定于內(nèi)轉(zhuǎn)移過程的速度很大程度上決定于產(chǎn)生此過程所包含的能態(tài)之間的相對能量差。產(chǎn)生此過程所包含的能態(tài)之間的相對能量差。 當(dāng)兩電子能級(jí)非

5、?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有當(dāng)兩電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，內(nèi)轉(zhuǎn)移就容易發(fā)生。重疊時(shí)，內(nèi)轉(zhuǎn)移就容易發(fā)生。 如激發(fā)單重態(tài)如激發(fā)單重態(tài)S S1 1的高振動(dòng)能級(jí)常與的高振動(dòng)能級(jí)常與S S2 2的低振的低振動(dòng)能級(jí)重疊，兩激發(fā)態(tài)的位能一樣，內(nèi)轉(zhuǎn)移過程動(dòng)能級(jí)重疊，兩激發(fā)態(tài)的位能一樣，內(nèi)轉(zhuǎn)移過程即容易發(fā)生，一般需即容易發(fā)生，一般需1010-13-131010-11-11秒的時(shí)間。秒的時(shí)間。(4)(4)體系間的系間竄躍：體系間的系間竄躍： 受激分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至能量較低的激發(fā)受激分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至能量較低的激發(fā)三重態(tài)的過程稱為系間竄躍。三重態(tài)的過程稱為系間竄躍。 如果兩個(gè)能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí)，這種躍

6、如果兩個(gè)能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí)，這種躍遷的幾率較大；這些處于激發(fā)三重態(tài)的分子，遷的幾率較大；這些處于激發(fā)三重態(tài)的分子，繼續(xù)通過輻射光能而回到基態(tài)單重態(tài)的各振動(dòng)繼續(xù)通過輻射光能而回到基態(tài)單重態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，所發(fā)出的輻射稱為磷光。能級(jí)，所發(fā)出的輻射稱為磷光。 由于不同物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及分析時(shí)所處的由于不同物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及分析時(shí)所處的化學(xué)環(huán)境不同，因此各去活化過程的速度也就化學(xué)環(huán)境不同，因此各去活化過程的速度也就不同。如果熒光發(fā)射過程比其他去活化過程的不同。如果熒光發(fā)射過程比其他去活化過程的速度快，就可看到熒光發(fā)射現(xiàn)象；相反，則速度快，就可看到熒光發(fā)射現(xiàn)象；相反，則看看不到不到熒光，或其強(qiáng)度減弱。熒光，

7、或其強(qiáng)度減弱。 任何熒光化合物都具有兩個(gè)特征光譜：任何熒光化合物都具有兩個(gè)特征光譜：激激發(fā)光譜發(fā)光譜和和發(fā)射光譜發(fā)射光譜。它們是熒光定性和定量分析。它們是熒光定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。的基本參數(shù)和依據(jù)。3-2 3-2 熒光分析法定量依據(jù)熒光分析法定量依據(jù)一一. .激發(fā)光譜激發(fā)光譜 以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)，繪得的譜圖稱熒光化合物的激發(fā)光譜。繪得的譜圖稱熒光化合物的激發(fā)光譜。 繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，在熒光的最大發(fā)射波繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，在熒光的最大發(fā)射波長處，改變激發(fā)光波長來測量相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。長處，改變激發(fā)光波長來測量相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

8、激發(fā)光譜與吸收光譜不僅形狀相同激發(fā)光譜與吸收光譜不僅形狀相同, ,而且波而且波長位置也一樣長位置也一樣, ,這是因?yàn)槲镔|(zhì)分子吸收能量的過這是因?yàn)槲镔|(zhì)分子吸收能量的過程就是被激發(fā)的過程程就是被激發(fā)的過程. .二二. .熒光熒光發(fā)射光譜發(fā)射光譜 簡稱熒光光譜或簡稱熒光光譜或發(fā)射光譜發(fā)射光譜。如果將激發(fā)光波如果將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處，然后掃描發(fā)射波長，長固定在最大激發(fā)波長處，然后掃描發(fā)射波長，測定不同發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度，即得到熒光發(fā)測定不同發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度，即得到熒光發(fā)射光譜。射光譜。下圖為萘的激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜和下圖為萘的激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜和磷光發(fā)射光譜。磷光發(fā)射光譜。激發(fā)

9、光譜和熒光發(fā)射激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的特點(diǎn)：光譜的特點(diǎn)：(1)(1)熒光發(fā)射光譜與激熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長無關(guān)，如前所述，發(fā)波長無關(guān)，如前所述，無論引起物質(zhì)激發(fā)的波無論引起物質(zhì)激發(fā)的波長是長是 1 1還是還是 2 2，但熒光，但熒光發(fā)射波長都為發(fā)射波長都為 3 3。 這是由于分子吸收了不同能量的光子可由基這是由于分子吸收了不同能量的光子可由基態(tài)激發(fā)到不同的電子激發(fā)能級(jí)而產(chǎn)生幾個(gè)吸收態(tài)激發(fā)到不同的電子激發(fā)能級(jí)而產(chǎn)生幾個(gè)吸收帶；由于較高激發(fā)態(tài)可通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動(dòng)弛豫帶；由于較高激發(fā)態(tài)可通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動(dòng)弛豫回到第一激發(fā)態(tài)的幾率很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于由高能回到第一激發(fā)態(tài)的幾率很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于由高能級(jí)激發(fā)態(tài)直接發(fā)射

10、光子的速度。級(jí)激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度。 故在熒光發(fā)射時(shí)，無論用哪一個(gè)波長的光故在熒光發(fā)射時(shí)，無論用哪一個(gè)波長的光輻射來激發(fā)，電子都從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)輻射來激發(fā)，電子都從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，所以熒光發(fā)能級(jí)返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長無關(guān)，只出現(xiàn)一個(gè)熒光譜帶。射光譜與激發(fā)波長無關(guān)，只出現(xiàn)一個(gè)熒光譜帶。(2)(2)熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系系 將某一熒光物質(zhì)的熒光光譜和它的吸收光將某一熒光物質(zhì)的熒光光譜和它的吸收光譜對比時(shí)，將發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)光譜間呈鏡像對稱關(guān)系。譜對比時(shí)，將發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)光譜間呈鏡像對稱關(guān)系。 吸

11、收光譜是物質(zhì)分子的外層電子由基態(tài)激吸收光譜是物質(zhì)分子的外層電子由基態(tài)激發(fā)至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)所致，其形狀發(fā)至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)所致，其形狀決定于決定于第一電子激發(fā)態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布狀況；中各振動(dòng)能級(jí)的分布狀況； 熒光光譜是激發(fā)態(tài)分子從第一電子激發(fā)態(tài)熒光光譜是激發(fā)態(tài)分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)所致，的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)所致，其形狀決定于其形狀決定于基態(tài)中基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布狀況；各振動(dòng)能級(jí)的分布狀況； 而而第一電子激發(fā)態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布與中各振動(dòng)能級(jí)的分布與基基態(tài)態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布相類似，因此熒光光譜與中

12、各振動(dòng)能級(jí)的分布相類似，因此熒光光譜與吸收光譜形狀相似，并呈鏡像對稱關(guān)系。吸收光譜形狀相似，并呈鏡像對稱關(guān)系。三熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系產(chǎn)生熒光的分子必須具備下列條件：產(chǎn)生熒光的分子必須具備下列條件：( (一一) )物質(zhì)分子必須具有與所照射的光輻射相同頻物質(zhì)分子必須具有與所照射的光輻射相同頻 率的吸收結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光。率的吸收結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光。( (二二) )吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后， 必須具有一定的熒光效率。必須具有一定的熒光效率。 熒光效率熒光效率也稱為也稱為熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率，表示物質(zhì)發(fā)，表示物質(zhì)發(fā)射熒光的

13、本領(lǐng)，為發(fā)出熒光量子數(shù)和吸收激發(fā)射熒光的本領(lǐng)，為發(fā)出熒光量子數(shù)和吸收激發(fā)光量子數(shù)的比值。光量子數(shù)的比值。 值一般值一般1 1，如羅丹明，如羅丹明B B的乙醇溶液，的乙醇溶液， =0.97=0.97；蒽乙醇溶液的蒽乙醇溶液的 =0.30=0.30；菲乙醇溶液的；菲乙醇溶液的 =0.10=0.10。 有許多吸光物質(zhì)不發(fā)熒光的有許多吸光物質(zhì)不發(fā)熒光的原因在于激發(fā)態(tài)原因在于激發(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能（去活化）過程中，除熒光發(fā)射分子釋放激發(fā)能（去活化）過程中，除熒光發(fā)射以外，還有許多非輻射躍遷與之競爭以外，還有許多非輻射躍遷與之競爭。顯然熒光。顯然熒光效率與物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及所處的環(huán)境密切相關(guān)。效率與物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及所

14、處的環(huán)境密切相關(guān)。什么樣的物質(zhì)會(huì)發(fā)生熒光什么樣的物質(zhì)會(huì)發(fā)生熒光? ?實(shí)驗(yàn)表明：實(shí)驗(yàn)表明：1.1.具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)體系的分子容易發(fā)熒光；其具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)體系的分子容易發(fā)熒光；其共軛度愈大，共軛度愈大， 電子越易被激發(fā)電子越易被激發(fā), ,分子的熒光效率分子的熒光效率也越大，熒光發(fā)射光譜向長波長方向移動(dòng)。也越大，熒光發(fā)射光譜向長波長方向移動(dòng)。2.2.具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子，具有較強(qiáng)的熒光。具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子，具有較強(qiáng)的熒光。這兩個(gè)物質(zhì)的熒光效這兩個(gè)物質(zhì)的熒光效率分別為率分別為1.01.0和和0.20.2。 這是由于加入了亞甲基使芴的這是由于加入了亞甲基使芴的剛性剛性和和共平面共平面性性增大的緣

15、故。這種結(jié)構(gòu)可減少分子振動(dòng)，即減增大的緣故。這種結(jié)構(gòu)可減少分子振動(dòng)，即減少了體系間跨越到三重態(tài)和碰撞去活的可能性。少了體系間跨越到三重態(tài)和碰撞去活的可能性。3.3.芳環(huán)化合物上不同取代基影響該芳環(huán)化合物的芳環(huán)化合物上不同取代基影響該芳環(huán)化合物的 熒光強(qiáng)度和熒光光譜。熒光強(qiáng)度和熒光光譜。給電子基團(tuán)給電子基團(tuán)常常使熒光常常使熒光 增強(qiáng)增強(qiáng)，吸電子基團(tuán)吸電子基團(tuán)會(huì)會(huì)減弱減弱甚至甚至破壞熒光破壞熒光；另外；另外 將原子序數(shù)大的原子引入到將原子序數(shù)大的原子引入到 電子體系中常使電子體系中常使 熒光減弱。熒光減弱。 如：氟苯的熒光效率為如：氟苯的熒光效率為0.160.16，氯苯為，氯苯為0.050.05，

16、溴苯為溴苯為0.010.01，而碘苯則沒有熒光。，而碘苯則沒有熒光。 取代基之間能形成氫鍵的，則熒光加強(qiáng)，反取代基之間能形成氫鍵的，則熒光加強(qiáng)，反之則熒光減弱。之則熒光減弱。 了解熒光和物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以幫了解熒光和物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以幫助我們考慮如何將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)，助我們考慮如何將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)，或?qū)晒鈴?qiáng)度不大或選擇性不高的熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)或?qū)晒鈴?qiáng)度不大或選擇性不高的熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度大及選擇性高的熒光物質(zhì)以提高化為熒光強(qiáng)度大及選擇性高的熒光物質(zhì)以提高分析的靈敏度。分析的靈敏度。四四. .熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系 按熒光發(fā)生機(jī)理，可得

17、到溶液的熒光強(qiáng)度按熒光發(fā)生機(jī)理，可得到溶液的熒光強(qiáng)度和該溶液吸收光的強(qiáng)度和該溶液吸收光的強(qiáng)度I Ia a以及熒光物質(zhì)的熒光以及熒光物質(zhì)的熒光效率效率 成正比：成正比： 根據(jù)根據(jù)BeerBeer定律：定律：A=lg(IA=lg(I0 0/I/It t)=)= bc bc I Ia a=I=I0 0-I-It t=I=I0 0(1-10(1-10- - bcbc) ) aFI代入上式：代入上式： 式中式中I I0 0是激發(fā)光強(qiáng)度是激發(fā)光強(qiáng)度, , 是摩爾吸光系數(shù)是摩爾吸光系數(shù), b, b是是 液層厚度液層厚度, c, c是樣品濃度。是樣品濃度。2.3030(1) bcFIe又又當(dāng)當(dāng) bc0.05b

18、c0.05時(shí)，可略去第二項(xiàng)后的各項(xiàng)。時(shí)，可略去第二項(xiàng)后的各項(xiàng)。 e e-2.303-2.303 bcbc =12.303=12.303 bcbc F= F= I I0 0(1(1e e-2.303-2.303 bcbc) ) F= F= I I0 01(12.3031(12.303 bc)=2.303bc)=2.303 I I0 0 bcbc 當(dāng)激發(fā)光當(dāng)激發(fā)光( (入射光入射光) )強(qiáng)度強(qiáng)度I I0 0一定，并且濃度一定，并且濃度c c很小時(shí)，熒光強(qiáng)度很小時(shí)，熒光強(qiáng)度F F與熒光物質(zhì)濃度與熒光物質(zhì)濃度c c成正比。成正比。即：即： F=KcF=Kc232.303( 2.303)( 2.303)

19、1 2.3032!3!bcbcbcebc 上式僅適用于稀溶液，對于較濃的溶液，上式僅適用于稀溶液，對于較濃的溶液，其其 bcbc超過超過0.050.05時(shí)，時(shí)，F(xiàn) F與與c c的線性關(guān)系將發(fā)生偏離。的線性關(guān)系將發(fā)生偏離。 由于濃度過高，使由于濃度過高，使熒光物質(zhì)分子間熒光物質(zhì)分子間以及以及熒熒光物質(zhì)分子同溶劑分子間光物質(zhì)分子同溶劑分子間的碰撞增加，導(dǎo)致無的碰撞增加，導(dǎo)致無輻射去活增加而發(fā)生自熄滅。輻射去活增加而發(fā)生自熄滅。 另外在熒光發(fā)射波長同化合物的吸收波長另外在熒光發(fā)射波長同化合物的吸收波長有重疊的情況下，物質(zhì)發(fā)射出的熒光可能有部有重疊的情況下，物質(zhì)發(fā)射出的熒光可能有部分被自身吸收，造成結(jié)

20、果負(fù)偏差。分被自身吸收，造成結(jié)果負(fù)偏差。3-3 3-3 影響熒光強(qiáng)度的因素影響熒光強(qiáng)度的因素 影響熒光強(qiáng)度的因素可歸納為如下幾方面影響熒光強(qiáng)度的因素可歸納為如下幾方面:一一. .激發(fā)光的照射激發(fā)光的照射 某些熒光物質(zhì)的溶液在入射光照射較長時(shí)間某些熒光物質(zhì)的溶液在入射光照射較長時(shí)間時(shí)，不會(huì)發(fā)生顯著變化；但有些熒光物質(zhì)的稀時(shí)，不會(huì)發(fā)生顯著變化；但有些熒光物質(zhì)的稀溶液則很容易發(fā)生光分解作用而引起熒光強(qiáng)度溶液則很容易發(fā)生光分解作用而引起熒光強(qiáng)度急劇降低。急劇降低。 其原因是其原因是某些物質(zhì)受光照后某些物質(zhì)受光照后, ,所吸收的能量所吸收的能量使分子內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)鍵發(fā)生斷裂使之分解。使分子內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)

21、鍵發(fā)生斷裂使之分解。如：硫酸奎寧溶液的濃度在如：硫酸奎寧溶液的濃度在1 1 g/mLg/mL以上時(shí)，長以上時(shí)，長時(shí)間經(jīng)紫外光照射，其時(shí)間經(jīng)紫外光照射，其F F值沒有顯著變化；但值沒有顯著變化；但如果溶液的濃度在如果溶液的濃度在0.020.02 g/mLg/mL以下時(shí)，以下時(shí)，F(xiàn) F值就有值就有顯著變化。顯著變化。二二. .溶劑溶劑 同一種熒光物質(zhì)在不同溶劑中，其同一種熒光物質(zhì)在不同溶劑中，其F F值和熒值和熒光光譜都可能有顯著不同。一般熒光峰的波長光光譜都可能有顯著不同。一般熒光峰的波長隨溶劑介電常數(shù)的增大向長波長方向移動(dòng)，即隨溶劑介電常數(shù)的增大向長波長方向移動(dòng)，即 增大。增大。 但也有相反的

22、情況，如苯氨萘磺酸在戊醇、但也有相反的情況，如苯氨萘磺酸在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中, ,隨極性隨極性 ，；且；且熒光光譜的位置與熒光光譜的位置與F F和溶劑極性之間的關(guān)系沒有和溶劑極性之間的關(guān)系沒有明顯的規(guī)律。明顯的規(guī)律。三三. .溫度溫度 溫度對熒光強(qiáng)度的影響較敏感。一般來說，溫度對熒光強(qiáng)度的影響較敏感。一般來說，溫度溫度 ，熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 。如熒光素的乙醇溶液在。如熒光素的乙醇溶液在00以下，每降低以下，每降低1010度，熒光效率約增加度，熒光效率約增加3%3%。 溫度增加溫度增加，熒光效率下降的主要原因是分熒光效率下降的主要原因是分子內(nèi)部能量發(fā)生變化子內(nèi)部

23、能量發(fā)生變化，溶質(zhì)與溶劑分子之間的溶質(zhì)與溶劑分子之間的碰撞機(jī)會(huì)增大碰撞機(jī)會(huì)增大，把能量消耗了把能量消耗了。四四. .溶液溶液pHpH值的影響值的影響 如果熒光物質(zhì)本身為弱酸或弱堿時(shí)，溶液如果熒光物質(zhì)本身為弱酸或弱堿時(shí)，溶液pHpH值的改變對溶液熒光強(qiáng)度將有很大的影響。值的改變對溶液熒光強(qiáng)度將有很大的影響。有些物質(zhì)在離子狀態(tài)無熒光，而有些則相反；有些物質(zhì)在離子狀態(tài)無熒光，而有些則相反；還有些在離子和分子狀態(tài)都有熒光，但兩者的還有些在離子和分子狀態(tài)都有熒光，但兩者的熒光光譜不一樣；等等。熒光光譜不一樣；等等。其原因在于它們的分子和離子的電子構(gòu)型不同。其原因在于它們的分子和離子的電子構(gòu)型不同。如苯胺

24、在如苯胺在pH=7pH=7 1212的溶液中會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光，的溶液中會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光，而在而在pHpH 2 2或或 1313的溶液中，都不發(fā)熒光：的溶液中，都不發(fā)熒光： 上式表明能發(fā)射熒光的是苯胺分子，而苯上式表明能發(fā)射熒光的是苯胺分子，而苯胺離子是不發(fā)射熒光的。胺離子是不發(fā)射熒光的。 金屬離子與有機(jī)試劑形成的熒光化合物受金屬離子與有機(jī)試劑形成的熒光化合物受pHpH值的影響更大值的影響更大。pHpH一方面影響配合物的形成一方面影響配合物的形成，另一方面另一方面影響影響配配合物的組成合物的組成。 如鎵離子與鄰苯二羥基偶氮苯在如鎵離子與鄰苯二羥基偶氮苯在pH3pH3 4 4的的溶液中形成溶液中形成1

25、:11:1配合物，產(chǎn)生熒光。但在配合物，產(chǎn)生熒光。但在pH6pH6 7 7的溶液中則形成的溶液中則形成1:21:2配配合物，不產(chǎn)生熒光。合物，不產(chǎn)生熒光。3-4 3-4 熒光光度計(jì)熒光光度計(jì) 熒光分析所用的儀器種類很多，簡單的有目熒光分析所用的儀器種類很多，簡單的有目測熒光計(jì)，光電熒光計(jì)等。較精密的有熒光分光測熒光計(jì)，光電熒光計(jì)等。較精密的有熒光分光光度計(jì)；它們的結(jié)構(gòu)、功能和價(jià)格差別很大。光度計(jì)；它們的結(jié)構(gòu)、功能和價(jià)格差別很大。組成熒光光度計(jì)的有四大部分：組成熒光光度計(jì)的有四大部分：激發(fā)光源激發(fā)光源、樣樣品池品池、 測量熒光的測量熒光的檢測器檢測器及用于選擇激發(fā)波及用于選擇激發(fā)波長和熒光波長的

26、長和熒光波長的濾光片或單色器濾光片或單色器。 一一. .光源光源 在紫外可見光區(qū)，可供熒光激發(fā)用的光源在紫外可見光區(qū)，可供熒光激發(fā)用的光源很多：鎢燈、碘鎢燈、氫燈、氘燈、汞燈、氙很多：鎢燈、碘鎢燈、氫燈、氘燈、汞燈、氙燈等。要求：燈等。要求：光源穩(wěn)定并具有一定強(qiáng)度光源穩(wěn)定并具有一定強(qiáng)度。穩(wěn)定。穩(wěn)定與否直接影響測量的重復(fù)性和精確度與否直接影響測量的重復(fù)性和精確度；而強(qiáng)度；而強(qiáng)度則影響測定的靈敏度。則影響測定的靈敏度。二二. .樣品池樣品池 樣品池必須用低熒光的材料制成，通常采樣品池必須用低熒光的材料制成，通常采用石英，形狀為方形或長方形。用石英，形狀為方形或長方形。三三. .單色器單色器 一般采

27、用光柵作單色器，第一激發(fā)單色器用一般采用光柵作單色器，第一激發(fā)單色器用于選擇激發(fā)波長；第二發(fā)射單色器用于分離出熒于選擇激發(fā)波長；第二發(fā)射單色器用于分離出熒光發(fā)射波長。光發(fā)射波長。四四. .檢測器檢測器 熒光的強(qiáng)度通常較弱，因此要求檢測器具有熒光的強(qiáng)度通常較弱，因此要求檢測器具有較高的靈敏度。一般由光電管和光電倍增管作檢較高的靈敏度。一般由光電管和光電倍增管作檢測器，檢測方向與激發(fā)光成直角。測器，檢測方向與激發(fā)光成直角。由光源發(fā)射的光經(jīng)激發(fā)單色器得到所需的激發(fā)波由光源發(fā)射的光經(jīng)激發(fā)單色器得到所需的激發(fā)波長長I I0 0，經(jīng)樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)吸收，經(jīng)樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)吸收，

28、透光強(qiáng)度為透光強(qiáng)度為I I；熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光；熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光F F。為消除入射光的影響，為消除入射光的影響，熒光測量通常在與激發(fā)光熒光測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行成直角的方向上進(jìn)行。第二發(fā)射單色器的設(shè)置是為了消除可能共存的第二發(fā)射單色器的設(shè)置是為了消除可能共存的其它光線的干擾，如其它光線的干擾，如散射光散射光以及溶液中其它雜以及溶液中其它雜質(zhì)所發(fā)生的熒光，以獲得所需要的熒光，讓其質(zhì)所發(fā)生的熒光，以獲得所需要的熒光，讓其作用于檢測器上，得到相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)放大作用于檢測器上，得到相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)放大后作記錄。后作記錄。3-5 3-5 分子熒光光度法的特點(diǎn)及應(yīng)用分子熒

29、光光度法的特點(diǎn)及應(yīng)用一一. .熒光光度法的特點(diǎn)熒光光度法的特點(diǎn)1.1.靈敏度靈敏度 與紫外與紫外可見光度法比較，熒光法檢測是在可見光度法比較，熒光法檢測是在 黑背景下進(jìn)行，所以其靈敏度要高出黑背景下進(jìn)行，所以其靈敏度要高出2 2 4 4個(gè)個(gè) 數(shù)量級(jí)，測定下限為數(shù)量級(jí)，測定下限為0.10.1 0.0010.001 g/mLg/mL。2.2.選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射又能依據(jù)特征吸收熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射又能依據(jù)特征吸收 來檢定物質(zhì)。如某幾個(gè)物質(zhì)的發(fā)射光譜相來檢定物質(zhì)。如某幾個(gè)物質(zhì)的發(fā)射光譜相 似，則可從激發(fā)光譜的差異來區(qū)分；而如果似，則可從激發(fā)光譜的差異來區(qū)分；而如果 它們的激發(fā)光譜相同，則可通過發(fā)射光譜將它們的激發(fā)光譜相同，則可通過發(fā)射光譜將 其區(qū)分。其區(qū)分。3.3.試樣量少，方法簡便試樣量少，方法簡便 因靈敏度較高，所以試樣用量較少，如采用微因靈敏度較高，所以試樣用量較少，如采用微 量池測定，用量僅為量池測定，用量僅為1010 L L。4.4.提供較多的物理參數(shù)提供較多的物理參數(shù) 該方法能提供