食管癌術(shù)前三氧化二砷對(duì)惡性b淋巴瘤細(xì)胞raji的抑制作用

1、                           作者： 宋小珍 朱麗 單保恩 彭華 【摘要】  目的  研究三氧化二砷對(duì)b淋巴瘤細(xì)胞raji的抑制作用和周期阻滯作用。方法  用mtt比色法檢測(cè)不同濃度as2o3對(duì)raji細(xì)胞的體外增殖抑制率。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)as2o3作用72小時(shí)后raji細(xì)胞p21的表達(dá)變化和細(xì)

2、胞周期的變化。結(jié)果  與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯下降。as2o3可使raji細(xì)胞周期阻滯于g0/g1期，并上調(diào)p21waf1/cip1的表達(dá)。結(jié)論  as2o3可使raji細(xì)胞阻滯于g0/g1期，其誘導(dǎo)周期阻滯的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)p21waf1/cip1的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  p21waf1/cip1  三氧化二砷  細(xì)胞周期 【abstract】 objective  to explore the inhibitory effect and cycle defect of arsenic trioxide on human

3、b lymphoma cells. method  mtt method was used to observe the growth inhibitory rate of raji cells treated with different dose of as2o3  in vitro. the expression level of p21 and cell cycle was measured by flow cytometry in raji cells treated with different dose of as2o3  72h. results

4、all the treated cells showed significantly decreased proliferation compared with control cells in vitro as detected by mtt method. the cell cycle of raji cells treated with as2o3 was arrested in g0/g1 phase and as2o3  can improve the expression of p21. conclusion as2o3 can arrest the cell cycle

5、 of raji cells in g0/g1 phase. the possible mechanism may be through up-regulation of p21 expression. 【key words】p21waf1/cip1   arsenic trioxide   cell cycl         三氧化二砷是中藥砒霜的主要成分，近年來(lái)因在治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病方面取得了滿意療效而引起廣泛的關(guān)注。研究表明，其作用機(jī)制可能是三氧化二砷影響了腫瘤細(xì)胞周期的

6、發(fā)展，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡1。本實(shí)驗(yàn)以raji細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察其是否能引起細(xì)胞周期阻滯及對(duì)周期相關(guān)基因表達(dá)的影響。         1  材料與方法         1.1材料  (1)細(xì)胞株:人b淋巴瘤細(xì)胞株raji由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存。（2）藥物：三氧化二砷為sigma公司產(chǎn)品。（3）主要試劑：rpmi1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，p21waf1/cip1鼠抗人單抗為北京中杉金橋生物

7、公司產(chǎn)品。         1.2方法         1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)  raji細(xì)胞用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的rpmi1640完全培養(yǎng)基，置于37，5%co2 飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每23d換液一次，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，設(shè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別用4、2、1mol/l as2o3處理細(xì)胞，未加藥組為對(duì)照組。        

8、 1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定  采用mtt比色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.3×105 /ml。取96孔板數(shù)個(gè)，每孔加入上述細(xì)胞懸液100l，再分別加入as2o3的貯存液，使as2o3的終濃度分別為0、1、2、4mol/l。每種藥物濃度為一組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入10lmtt，在相同條件下再繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出，離心后吸去上清夜，每孔加入100l二甲基亞砜，振蕩1015分鐘，20分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)為570nm的吸光度a值，各濃度時(shí)間點(diǎn)取平均值，根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（

9、對(duì)照組a值實(shí)驗(yàn)組a值）/對(duì)照組a值×100%。         1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化  收集不同濃度as2o3處理的raji細(xì)胞，用pbs清洗2次再將細(xì)胞沉淀充分混勻，用70%的冷乙醇4固定過(guò)夜，然后離心去除固定液，pbs清洗一次，rna酶37處理1小時(shí)，與pi室溫反應(yīng)10min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定，應(yīng)用single histogram statistic分析軟件分析細(xì)胞周期變化。         1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)

10、p21waf1/cip1 蛋白的表達(dá)變化  收集不同濃度as2o3處理的raji細(xì)胞，用pbs清洗2次再將細(xì)胞沉淀充分混勻，用70%的冷乙醇4固定過(guò)夜，然后離心去除固定液，pbs清洗一次，加入 p21waf1/cip1單抗4孵育1h,再加入熒光標(biāo)記的二抗孵育1h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果。         1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  數(shù)據(jù)分析用spss13.0軟件處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，p 0.05為差異有顯著性。       &

11、#160; 2  結(jié)果         2.1 as2o3抑制raji細(xì)胞的生長(zhǎng)  見(jiàn)圖1。as2o3抑制raji細(xì)胞生長(zhǎng)具有時(shí)間、劑量依賴性。1、2、4mol/l的as2o3處理13天，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，差異有顯著性意義（p 0.01）。         2.2 as2o3誘導(dǎo)raji細(xì)胞阻滯于g0/g1期 。1、2、4mol/l的as2o3處理72小時(shí)后，隨著濃度的增加，g0/g1期細(xì)胞增加，g0/g1期細(xì)胞所占比例各

12、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異有顯著性意義（p 0.01），伴隨著g0/g1期細(xì)胞數(shù)增加，s和g2/m期細(xì)胞數(shù)都減少。         2.3 as2o3能上調(diào)raji細(xì)胞p21waf1/cip1蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖2。1、2、4mol/l的as2o3處理72小時(shí)后，隨著濃度的增加，各實(shí)驗(yàn)組p21waf1/cip1蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各濃度組與對(duì)照組相比均有顯著性差異（p 0.01）。1：4mol/l as2o3處理后 2：2mol/l as2o3處理后 3：1mol/l as2o3處理后 4：對(duì)照    

13、;      3  討論          異常增殖是惡性腫瘤的特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是治療腫瘤的途徑之一。本研究結(jié)果顯示，1、2、4mol/l的as2o3對(duì)raji細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。并且1、2、4mol/l的as2o3處理raji細(xì)胞，g0/g1期細(xì)胞的比例明顯增加，s和g2/m期細(xì)胞比例明顯降低，提示as2o3使raji細(xì)胞阻滯于g0/g1期。  

14、       p21waf1/cip1基因定位于人染色體6p21.2,是p53的下游基因2，多項(xiàng)研究已證實(shí)p21waf1/cip1基因?qū)δ[瘤生長(zhǎng)的抑制作用是確定的，是一種重要的抑癌基因，可通過(guò)其編碼蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展3。p21waf1/cip1基因編碼的蛋白是第一個(gè)被證實(shí)的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子                （cdk1），也是目前已

15、知具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子。通過(guò)依賴和非依賴p53途徑，與包括cdk2、 cdk4在內(nèi)的多種相應(yīng)的cyclins/cdk 復(fù)合物結(jié)合，使cdks失活，減弱對(duì)rb蛋白的磷酸化作用4，和（或）抑制細(xì)胞增殖核抗原（pcna）活性，使細(xì)胞發(fā)生g1s期阻滯，從而對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞無(wú)限增殖5。         本研究結(jié)果顯示，1、2、4mol/l的as2o3處理raji細(xì)胞后，p21waf1/cip1基因的mrna和蛋白表達(dá)水平均升高。提示p21waf1/cip1表達(dá)上調(diào)可能是as2o3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞

16、發(fā)生細(xì)胞周期g0/g1期阻滯，從而發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制。 參 考 文 獻(xiàn)  1 郭軍，張志愿三氧化二砷誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討j中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2003，38(1)：20-23 2 el-deiry ws,tokin t,velculescu ve,et al.waf1,a potential mediator of p53 tumor suppression.cell,1993,75(4):817-825. 3 noda h, maehara y, irie k, et al.growth pattern and expressions of cell cycle regulator proteins p53 and p21waf1/cip1 in early gastric carcinoma. cancer,2001,92(7):1828-1835. 4 noda a,ning y, venable sf,et al.cloning of senescent