有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用全面

1、有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用浙江大學(xué)理學(xué)院無機(jī)與材料化學(xué)研究所劉子陽教授，博士生導(dǎo)師 第一部分：理論基礎(chǔ)第一部分：理論基礎(chǔ) 第二部分：第二部分： LCQ離子阱質(zhì)譜儀原理及應(yīng)用離子阱質(zhì)譜儀原理及應(yīng)用 第三部分：上機(jī)實(shí)驗(yàn)第三部分：上機(jī)實(shí)驗(yàn)。 100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.7 1.1 質(zhì)譜的基本概念 Mass Spectromety 特殊的天平：稱量離子的質(zhì)量。 質(zhì)譜學(xué)：是一門研究氣相離子結(jié)構(gòu)、 性質(zhì)及反應(yīng)行為的科學(xué)。 定性：化合物的結(jié)構(gòu) 定量：混合物的組成 領(lǐng)域： 化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、 環(huán)境、物理、材料、能源等 4S特性： Sens

2、itivity 靈敏 Speed 快速 Specificity 特異 Stoichiometry 化學(xué)計量 1.2 質(zhì)譜分類質(zhì)質(zhì) 譜譜同位素質(zhì)譜同位素質(zhì)譜生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定、定量分析、氣相離子化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定、定量分析、氣相離子化學(xué)化學(xué)、化工化學(xué)、化工環(huán)境、地球環(huán)境、地球藥學(xué)、毒物藥學(xué)、毒物學(xué)、刑偵學(xué)、刑偵生命、醫(yī)學(xué)、生命、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)有機(jī)質(zhì)譜有機(jī)質(zhì)譜無機(jī)質(zhì)譜無機(jī)質(zhì)譜 1.3 質(zhì)譜學(xué)的發(fā)展歷史1906年：物理獎 J. I. Thomson 貢獻(xiàn)：正電荷離子束在磁場中的偏轉(zhuǎn) 磁質(zhì)譜儀的基 礎(chǔ)同位素分析1989年：物理獎 W. Paul 貢獻(xiàn)：離子阱技術(shù)的發(fā)明。2002年 ：化學(xué)獎J.

3、 B. Fenn Virginia Commonwealth University, USA 貢獻(xiàn)：電噴霧(ESI)電離方法 生物大分子分析 Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules, J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong and C. M. Whitehouse, Science 246, 64 (1989) Koichi Tanaka (田中耕一) Shimadzu Corporation,Japan 貢獻(xiàn)：激光輔助解吸電離質(zhì)譜(MALDI)電離方

4、法 生物大分子分析 Rapid Communications in Mass Spectrometry 2, 151 - 153 (1988), Koichi Tanaka, Hiroaki Waki, Yutaka Ido, Satoshi Akita, Yoshikazu 1886年，Goldstein 發(fā)現(xiàn)正電荷離子 1898年，Wien 利用電場和磁場使正電荷離子偏轉(zhuǎn) 1912年，Thomson 研制第世界上一臺質(zhì)譜儀，氖同位素的發(fā)現(xiàn) 1918年，Dempster 電子轟擊電離(Electron ionization)及磁聚焦 1919年，Aston 精密儀器，測定50多種同位素，第一

5、張同位素表 1934年，Stephens 均勻扇形磁場，球差和質(zhì)量色散公式 Herzog 和 Hintenberger 電磁場組合，離子光學(xué)系統(tǒng) 1940年，Nier 扇形磁場偏轉(zhuǎn)質(zhì)譜計，雙聚集系統(tǒng) 商品儀器的雛形 235U，電磁制備方法，第二次世界大戰(zhàn)期間 在石油、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用 1946年，Stephens 飛行時間質(zhì)譜(Time-of flight mass analysis) 1952年，Martin 氣相色譜方法 1953年，Paul等 四極桿分析器(Quadrupole analyzers) 1956年，Gohlke and McLafferty 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)

6、 Beynon 高分辨質(zhì)譜儀 (High-resolution MS) 1965年，Hipple等 離子回旋共振(Ion Cyclotron Resonance) 1966年，Munson and Field 化學(xué)電離(Chemical ionization) 1967年，McLafferty and Jennings 串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry) 1973年，McLafferty 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC/MS)，熱噴霧方法 1974年，Comisarow和Marshall 傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS) 1981年，Barber等 快原子

7、轟擊電離質(zhì)譜(FAB MS)， 生物中，小分子，2000以內(nèi) 1989年，J. B. Fenn 電噴霧電離 Koichi Tanaka 基質(zhì)輔助激光解吸電離 1990年，Katta and Chait 電噴霧電離質(zhì)譜觀察蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 1993年，商品電噴霧質(zhì)譜儀 1995年，付立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（與ESI和MALDI聯(lián)用） 1998年，高分辨飛行時間質(zhì)譜儀（Delay Extract, Reflectron技術(shù)） 20世紀(jì) 50年代，同位素質(zhì)譜研究，配合核研究，技術(shù)來自于前蘇聯(lián) 70年代，引進(jìn)質(zhì)譜儀， 磁質(zhì)譜：VG-ZAB-2F, 3F（7臺，北大，南京、南開、蘭州、 中科大、武漢、

8、中山） VG-7070E（20多個單位） Finnigan MAT系列 80年代，中國科學(xué)院科學(xué)儀器廠，仿制7070E型質(zhì)譜儀 KYKY系列 1980年，中國質(zhì)譜學(xué)會，杭州成立，依托于科學(xué)儀器廠 質(zhì)譜學(xué)報創(chuàng)刊中國質(zhì)譜學(xué)會機(jī)構(gòu)：無機(jī)專業(yè)委員會、同位素專業(yè)委員會、 有機(jī)質(zhì)譜專業(yè)委員會、生物醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會、 儀器與教育專業(yè)委員會1.3 常用概念 質(zhì)譜圖中的橫坐標(biāo)，質(zhì)量與電荷之比。 若離子所帶電荷為z = 1，則質(zhì)荷比等于該離子的質(zhì)量數(shù)。 離子是以12C原子的1/12定義為一個質(zhì)量單位，用u表示。 1u=1.66054x10-27kg 其它常用符號，Da, 道爾頓 1Da=1u兩種表示方法 百分強(qiáng)度：

9、所有峰的強(qiáng)度之各為100，每個離子所占的份額即為其百分強(qiáng)度，百分強(qiáng)度= (Ii/Ii) 100% Ii，第i 個離子的強(qiáng)度。 基峰強(qiáng)度：質(zhì)譜圖中離子強(qiáng)度最大的峰稱為基峰，定義它的強(qiáng)度為100，即IB=100， 其它離子強(qiáng)與之相比的百分強(qiáng)度稱為該離子的強(qiáng)度?；瘜W(xué)上，氖的原子量為20.2, 質(zhì)譜上：氖不在m/z20.2處出峰，而是在m/z20和m/z22處各出一個峰， 該峰的相對強(qiáng)度為10:1。為什么？質(zhì)譜測定的是微觀離子，不是宏觀上的平均的概念。元素AA+1A+2元素類型質(zhì)量% 質(zhì)量%質(zhì)量%H110020.015AC12100131.1A+1N14100150.37AO16100170.0418

10、0.20A+2F19100ASi28100295.10303.40A+1,A+2P31100AS32100330.80344.40A+2Cl351003732.5A+2Br791008198.0A+2I127100A表1 常見元素的天然同位素豐度元素分類情況：A: H, F, P, IA+1: C, NA+2: O, Si, Cl, Br同位素分布的二項(xiàng)式規(guī)則： 對A+1和A+2元素 32! 3)2)(1(! 2) 1(1)1 (bnnnbnnnbbnb: A+1或A+2同位素的天然豐度n: 質(zhì)譜峰中A+1或A+2元素的個數(shù)A+1元素峰位置MM+1M+2M+3A+2元素峰位置MM+2M+4M+

11、6質(zhì)譜峰強(qiáng)度1nbn(n-1)b2/2!n(n-1)(n-2)b3/3!12C5H12+ M m/z7212C413C1H12+ M+1 m/z7312C313C2H12+ M+2 m/z7412C213C3H12+ M+3 m/z7512C113C4H12+ M+4 m/z76020406080100RAm/zq例： 79Br 100%, 81Br 98%100% M M+2 M+4 M+6 Br, n=1: 1 1 Br2, n=2: 1 2 1 Br3, n=3: 1 3 3 1 例：35Cl 100%, 37Cl 32.5% M M+2 M+4 M+6 Cl, n=1: 1 0.325

12、 Cl2, n=2: 1 0.650 0.106 Cl3, n=3: 1 0.975 0.317 0.034 MM+2M+4M+6MM+2M+4M+2MBrBr3Br210010010033.310050509833.3MM+2M+4M+6MM+2M+4M+2MClCl3Cl210010010010.631.765.032.53.497.5q例：12C 100%, 13C 1.1%C60, n=60, b=1.1% M M+1 M+2 M+3 12C60 13C12C59 13C212C58 13C312C57 720 721 722 723 1 nb n(n-1)b2/2! n(n-1)(n

13、-2)b3/3! 100 66 21 4.6 723720722721100214.666C60的質(zhì)譜圖元素組成的判斷：用同位素豐度的分布可幫助判斷峰的元素組成。方法：1、獲取最高質(zhì)量峰，分子離子峰。 分子離子峰受氫遷移的影響最小。2、最大豐度 信號強(qiáng)有利于判斷。3、A峰的選擇 一個峰組中的A峰應(yīng)是僅含最大豐度同位素(如12C、16O、35Cl)的最高質(zhì)量峰。 優(yōu)先考慮A+2型元素存在的可能性，因A+2峰受A+1元素的影響較小，A+2元素同位素的自然豐度也較高，容易判斷，尤其是氯和溴。 然后再判斷A+1元素，可根據(jù)其與A峰的強(qiáng)度比，大致判斷A+1元素的種類和所含個數(shù)。4、確定元素組成的一致性

14、從分子離子峰M+得到元素組成信息，需要與較小的碎片離子的組成吻合。 質(zhì)量范圍(Mass Range) 質(zhì)譜儀所能檢測的最小到最大的質(zhì)量范圍。 不同儀器： 四極桿 1600Da，14000Da， 磁質(zhì)譜：110000Da 飛行時間質(zhì)譜：無上限 離子阱質(zhì)譜：12000Da，14000Da 不同要求：氣體分析， 1300Da 氣相色譜質(zhì)譜， 1600Da，800Da 有機(jī)質(zhì)譜， 12000Da 生物分子， 110000Da或更大 分辨力(Resolution Power, RP) 分辨力：分開兩個鄰近質(zhì)量峰的能力。 何為分開：若兩個相鄰峰的峰谷低于峰高的10%(或5%，50%)，則認(rèn)為 是分開的。

15、A: 未分開 B:部分分開 C:全分開 分辨差 分辨較差 分辨達(dá)到要求m2m1數(shù)學(xué)定義：mmRPmmmmmRP1211 (1) m1和m2代表兩個相鄰峰的質(zhì)量數(shù) (2) m代表某一峰的質(zhì)量，m代表半峰寬分辨率的另外一種定義：分辨率=M/MM為半峰高處峰寬 分開的定義10% valleym/MM+H+m/zintensity組成整數(shù)質(zhì)量精確質(zhì)量CO2827.994914N22828.006158C2H42828.031299若儀器分辨力很低，如RP=200，則對以上三個分子不能分開，混為一峰。若要分開以下混合物，則必需有如下分辨力CO-C2H4: (RP)2 = 27.994914/(28.03

16、1299-27.994914) = 770N2-C2H4 : (RP)3 = 28.006158/(28.031299-28.006158) = 1100CO-N2 : (RP)1 = 27.994914/(28.006158-27.994914) = 2490當(dāng)儀器分辨力達(dá)到770時， 只能夠只分開 CO-C2H4 。當(dāng)儀器分辨力達(dá)到1100時，能夠分開CO-C2H4 和N2-C2H4 當(dāng)儀器分辨力超過2500時，三者全部分開。一般低分辨儀器在2000左右。10000以上時稱高分辨。FT-ICR-MS分辨力可達(dá)2百萬。高分辨質(zhì)譜進(jìn)行元素組成分析：任何一種同位素的質(zhì)量并不是正好的整數(shù)。12C的

17、準(zhǔn)確質(zhì)量為12.00000000, 1H = 1.007782506，14N = 14.00307407，16O = 15.99491475，末位有效數(shù)字。 每一個同位素都具有唯一的、特征的“質(zhì)量虧損”，離子的質(zhì)量包含了同位素的總的質(zhì)量虧損，也是特征的，以此來鑒定離子的同位素和元素組成。q例 m=43.0184Da的離子必定是C2H3O+，不可能是C3H7+(m=43.0058)或C2H5N+(m=42.9984)，或CH3N2+(m=43.0296)。 為了區(qū)分這四個離子，測量的質(zhì)量的準(zhǔn)確度需達(dá)到130ppm。即小數(shù)點(diǎn)后第四位是準(zhǔn)確的。 元素組成信息隨著質(zhì)量的增加而呈指數(shù)地上升，對質(zhì)譜質(zhì)量的

18、測定準(zhǔn)確度要求更高。q例 分子量為310的質(zhì)譜峰，已知它們的元素組成限于碳、氫、氮和氧，且最多不超過3個氮原子和4個氧原子。如果將其各種組合出來的質(zhì)量能夠區(qū)分開來，要求的質(zhì)量準(zhǔn)確度達(dá)到2ppm，這是目前最高質(zhì)量分辨力的FT-ICR-MS勉強(qiáng)能夠達(dá)到的水平。注意事項(xiàng)質(zhì)譜學(xué)上的高分辨包含兩層含義： 高的分辨本領(lǐng) 保證兩個靠得很近的峰能夠分開來，從而知道是兩個峰而不是一個峰。 良好的線性行為 用已知精確質(zhì)量的離子去得到待測定離子的質(zhì)量數(shù)，不容許二者峰的質(zhì)量是一樣的(重疊在一起)，二者之間必有一定的質(zhì)量差異，質(zhì)譜儀的線性不好，用已知精確離子的質(zhì)量來得到待測定離子的質(zhì)量，就會因此而產(chǎn)生偏差，從而造成誤差

19、，兩者距離越遠(yuǎn)，這種誤差越大。 良好的穩(wěn)定性 磁質(zhì)譜，飛行時間質(zhì)譜儀，離子回旋共振質(zhì)譜儀：分辨力、線性和穩(wěn)定性好，屬高分辨質(zhì)譜儀。離子阱質(zhì)譜儀：分辨力高，線性低，準(zhǔn)高分辨質(zhì)譜儀，用于判斷質(zhì)譜峰帶 的電荷數(shù)。四極桿質(zhì)譜儀：分辨力低，線性好，不屬于高分辨質(zhì)譜儀。1.4 質(zhì)譜學(xué)的專著、期刊和國內(nèi)國際會議 專專 著：著： 1. Interpretation of Mass Spectra, F.W.Maclafferty 2. Mass Spectrometry for Biotechnology, Gary Siuzdak 3. Mass Spectrometry in the Biological Sciences, A.L.Burlingame 4. 有機(jī)質(zhì)譜基礎(chǔ)，陳耀祖，科學(xué)出版社 5. 質(zhì)譜解析，F(xiàn). W. McLafferty著，王光輝等譯，化學(xué)工業(yè)出版社， 期期 刊：刊： 1. Rapid Communication in Mass Spe