初論免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化

1、 初論免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化rkyl              王麗 張秋金 林齊心 王小亞 福州 350002oilc ©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地t2單克隆抗體的問世與免疫組織化學(xué)檢測系統(tǒng)持續(xù)快速的發(fā)展，使免疫組織化學(xué)技術(shù)在現(xiàn)代病理診斷中的應(yīng)用日益廣泛，且倍受病理界的關(guān)注與青睞。最初由70年代初期僅在實驗室中科研的嘗試，其間歷經(jīng)二三十年時間，該項技術(shù)今日已發(fā)展到成為常規(guī)病理診斷中必不可少的可靠的輔助診斷手段。由于隨著免疫組織化學(xué)試劑的大量涌現(xiàn)，1998年美國fda頒發(fā)了

2、免疫組化試劑重新分類標(biāo)準(zhǔn)，將其免疫組化試劑抗體統(tǒng)分為三大類，類抗體，在病理鑒別診斷中用于判定組織起源指標(biāo)；類抗體，為雌、孕激素受體，用于乳腺癌患者中雌、孕激素受體的檢測，雌、孕激素受體激素水平的測定以指導(dǎo)患者的內(nèi)分泌治療；類抗體，為現(xiàn)今仍處于科研文獻(xiàn)論證階段的新試劑1。試劑的規(guī)范化要求越來越受到重視。po分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，治療性的人源性單克隆抗體引入了臨床，免疫組織化學(xué)技術(shù)已經(jīng)作為獨立的一項檢測指標(biāo)用于指導(dǎo)臨床個性化治療2。目前已有十幾種人源性單克隆抗體，通過了臨床期實驗。代表性的c-erbb-2在乳腺癌組織中的表達(dá)，該項免疫組織化學(xué)檢測方法已經(jīng)通過美國fda認(rèn)證，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果直接指導(dǎo)臨

3、床治療。er/pr檢測是目前病理科常規(guī)開展的免疫組化檢查項目，每個實驗室都日常進(jìn)行er/pr檢測，但值得注意的是每個實驗室間得出的實驗結(jié)果往往大相徑庭3,4,5，er/pr檢測的實驗結(jié)果直接指導(dǎo)乳腺癌患者的預(yù)后與治療，隨著檢測方法直接滲透到病人預(yù)后與治療方案中，所以方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化重要性的問題日趨突出與嚴(yán)峻。就免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的概念新近由美國國家臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會（national committee for clinical laboratory standards nccls）于1999年正式出臺了綱要性文件6,7,8。隨著國內(nèi)免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，免疫組化實驗結(jié)果的可靠性、可重現(xiàn)

4、性以及實驗室之間的學(xué)術(shù)交流也愈來愈受到高度重視。實驗室間的交流需要采用通用的術(shù)語和實驗規(guī)則，實驗室的儀器設(shè)備、技術(shù)操作規(guī)范、實驗技術(shù)人員的資格等外部環(huán)境條件都有必要得到重視9，這些影響因素也常常是令實驗室感到棘手的問題，同時免疫組織化學(xué)實驗技術(shù)在實際操作中還仍然存在著許多有待商榷的問題2。盡管在免疫組織化學(xué)理論上十分的簡單，但日前讓每個實驗室能夠持續(xù)穩(wěn)定地完成可靠的實驗染色結(jié)果還仍然是頗為困難的事情，因為諸多的因素最終可以影響免疫組化的結(jié)果，若想得到最佳可靠的實驗結(jié)果，當(dāng)務(wù)之急是將免疫組織化學(xué)技術(shù)中的全部實驗程序變得易于操作與掌握，達(dá)成概念上的標(biāo)準(zhǔn)化。y一、免疫組化診斷成功的關(guān)鍵要素wq1病理

5、科主任&mt要確保實驗室中免疫組化診斷成功的完成，首要關(guān)鍵因素是病理科主任必須具有相當(dāng)過硬的免疫組化診斷知識與豐富的免疫組化技術(shù)經(jīng)驗，尤其在免疫組化結(jié)果與常規(guī)診斷出現(xiàn)矛盾時更顯突出3。病理科主任應(yīng)十分清楚免疫組織化學(xué)技術(shù)是一項實驗性很強的技術(shù)，是一門需要進(jìn)行繼續(xù)再教育的課程，并有責(zé)任對病理醫(yī)生進(jìn)行不斷地培訓(xùn)，提高他們的免疫組化診斷水平，特別是在技術(shù)人員將一張染色比較差的切片呈現(xiàn)在面前，以及聽到病理醫(yī)生抱怨病理技術(shù)人員總是做不好免疫組化染色時，更應(yīng)客觀地對待。病理醫(yī)生往往是靜止地看待免疫組化染色結(jié)果，往往這種認(rèn)識是不妥當(dāng)?shù)?。在實際工作中，病理科主任還需要不斷地學(xué)習(xí)有關(guān)免疫組化的文獻(xiàn)資料，

6、加深了解多種抗體在組織中預(yù)期表達(dá)情況，避免錯誤的判斷與解釋。*zj2病理技術(shù)工作者m病理技術(shù)工作者也是免疫組織化學(xué)中成功的關(guān)鍵因素，病理技術(shù)人員應(yīng)該在制備超薄組織切片和免疫組化實驗操作技術(shù)訓(xùn)練中過關(guān)，得到認(rèn)可，要十分清楚地懂得免疫組織化學(xué)中的實驗原理，并且在日常實際工作中需要及時地與病理主任進(jìn)行信息交流。q3可靠的試劑與實驗方法j3m2$免疫組化實驗檢測方法多種多樣，抗體的種類繁多，商品化的試劑也越來越簡便、高效與便捷。目前絕大多數(shù)實驗室使用的檢測系統(tǒng)均為辣根過氧化物酶（hrp）為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)，dab顯色。每個實驗室必須確保購買有產(chǎn)品質(zhì)量保證的著名廠商的試劑，值得注意的是還必須在本實驗室內(nèi)進(jìn)

7、行最佳實驗條件的摸索工作。0=v4實驗質(zhì)控對照的設(shè)立a!1x?免疫組織化學(xué)實驗中實驗對照的概念在許多實驗室內(nèi)都是極其容易被忽視的問題，但實驗對照絕不是一個虛設(shè)的多余的程序，在每次的實驗中它作為敏感性與特異性的對照作用相當(dāng)?shù)闹匾叶嘟M織芯片在對照實驗中將發(fā)揮越來越大的作用。wm+z©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地s二、免疫組化染色技術(shù)vw在免疫組織化學(xué)實驗中，每個實驗室常選擇不同的檢測系統(tǒng)，實驗技術(shù)操作方法亦不盡相同，所以做好一張滿意的免疫組化切片也并非輕而易舉，突出的問題是每次實驗結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較差，原因在于免疫組織化學(xué)是一項技術(shù)性很強的實驗方

8、法，它不可能有適合于所有實驗室和所有抗體的唯一實驗方法。但隨著免疫組化的廣泛應(yīng)用與實驗室間日益密切的信息與技術(shù)的交流，免疫組化技術(shù)的焦點已經(jīng)集中在了對其標(biāo)準(zhǔn)化實質(zhì)性問題的探討上。90年代biotin-streptavidin-hrp方法的出現(xiàn)，其方法靈敏度高，操作簡便，很快被各實驗室廣泛接受與使用。所以免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的討論目前是建立在辣根過氧化物酶（hrp）檢測方法基礎(chǔ)上而進(jìn)行展開的3。j"x<©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地7>xa免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的染色方法t1. 將石蠟組織切片粘貼在防脫玻片上；ove#;2. 切片二甲苯脫蠟，梯

9、度酒精脫水至水化；$3. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性，緩沖液沖洗；s-g"l|4. 血清封閉孵育，緩沖液沖洗；x#boa35. 如果需要，緩沖液沖洗，抗原修復(fù)處理（熱抗原修復(fù)或酶消化）；eth6. 加載相應(yīng)的一抗，孵育，緩沖液沖洗；&7. 加載對應(yīng)的二抗，孵育，緩沖液沖洗；gx$|mt8. 加載相應(yīng)的酶結(jié)合物孵育，緩沖液沖洗；i9. 加載對應(yīng)的酶底物，顯色，復(fù)染，脫水，封片，觀察。p;=©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地vkmm*（一）染色前（preanalytic or pre-stain）處理因素lis1取材、脫水、浸蠟"

10、p;2免疫組化要求組織離體后應(yīng)立即固定，理想的取材厚度是2mm，組織在脫水機中的處理條件應(yīng)十分妥當(dāng)，大量的實驗室經(jīng)驗公認(rèn)在加熱抗原修復(fù)過程中組織脫片的主要原因是取材過厚以及脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。如果h&e切片尚做不出滿意的染色結(jié)果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質(zhì)量。s!g,lo2福爾馬林固定$y在眾多的組織固定液中，如甲醛、乙醇、戊二醛、b5 、脫鈣液等等不同種類的固定液，各種固定液在不同實驗方法（如pcr、電鏡、免疫組化、分子雜交等）的使用中各有千秋10,11。但在保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價格上，福爾馬林都是首選。在免疫組化中首選

11、的固定液是10%中性緩沖福爾馬林液（市售甲醛1：9稀釋），福爾馬林固定引起的組織抗原決定簇的封閉與交聯(lián)可以通過抗原修復(fù)方法來修正12，為確保離體組織的抗原性，值得高度重視的是離體組織須馬上固定13,14，病理醫(yī)生有責(zé)任與手術(shù)送檢科室進(jìn)行配合，避免手術(shù)后的離體組織隨意處置，組織離體后固定一般不要超過15分中，固定在常溫條件下時間為8-24小時，同時還要注意的重要一點是要避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原損失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴(yán)重，抗原幾乎不能被檢出 15。組織同樣不能長時間放置在70%的乙醇中。脫鈣液對抗原破壞較為嚴(yán)重，所以脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時間都必須盡量

12、控制在最低的限度16。z!)v3防脫片的制備 ran4!防脫玻片的處理各個實驗室間一般多采用不同的粘附劑，目前通用的是sigma多聚左旋賴氨酸（poly-l-lysine）或硅化片，不論是免疫組化還是原位雜交該粘附劑都具有極好的防脫片效果17。2)fm/m4包埋與切片<固定后的組織，過熱或高溫的石蠟包埋容易導(dǎo)致抗原的破壞，因為石蠟熔液是非緩沖體系，尤其對固定條件不佳的組織影響更大，需選用低熔點的石蠟。推薦廣東茂名石蠟廠的低熔點石蠟。切片的厚度在4-5m，過厚的切片，不僅容易脫片，還影響免疫反應(yīng)及鏡下觀察。0?|5烤片1-kwt切片在56-60恒溫箱里烤片至少1小時才不至于脫片，邁新實驗室

13、推薦58-60恒溫箱里烤片2小時。也有的實驗室在58-60恒溫箱里過夜烤片。但高溫烤片對抗原有破壞，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。5;zx6切片保存qet<=v許多大的實驗室研究人員習(xí)慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。在實驗中邁新實驗室發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個月以上，免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性情況。故進(jìn)行了新、舊切片的保存時間對照實驗，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個月、三個月、半年、一年與新切片進(jìn)行成對對照實驗。實驗結(jié)果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個月，

14、抗原對多數(shù)抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽性標(biāo)記結(jié)果，保存一年以上僅有個別的切片能夠有微弱的陽性表達(dá)，尤其核表達(dá)的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報道。究其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān)，所以在實際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存，也可4冰箱冷藏保存，值得科研單位在連續(xù)性課題實驗中注意切片的保存。r-ne7脫蠟%8:免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)h&e脫蠟步驟相同，免疫組化實驗室中脫蠟需與h&e常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水至水化。*9k©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的

15、病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地ser（二）免疫組化實驗中的抗原修復(fù)p1. 抗原修復(fù)方法5$目前在免疫組化實驗中，抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素，抗原修復(fù)方法有多種，但經(jīng)過多年實驗室的實驗驗證大多數(shù)實驗室采用的是酶消化法與加熱抗原修復(fù)兩種方法。pcz7（1） 酶消化法i(,酶消化法是最早的抗原修復(fù)方法18,19,20,21，消化酶的作用在于能夠暴露因組織固定而導(dǎo)致的抗原決定簇的封閉，以增強染色效果。消化酶有多種，如胰酶、dnase 、蛋白酶k、胃酶等等，現(xiàn)僅有極少數(shù)的抗體可以選擇酶消化的方法。由于熱抗原修復(fù)方法的廣泛使用，酶消化方法在免疫組織化學(xué)方法中的應(yīng)用已越來越少。aeaq（2）

16、 加熱抗原修復(fù)（heat induced epitope retrieval hier）j3t加熱抗原修復(fù)最初1991年由shi等報導(dǎo)22,23,24，已經(jīng)經(jīng)過了10多年大量實驗室的實驗驗證，加熱處理后免疫組化的染色敏感度大幅度地提高，其機理推測可能是加熱打開了組織抗原因福爾馬林固定所引起的抗原決定簇的交聯(lián)，但機理目前仍然還不是十分清楚。某些研究表明組織中鈣結(jié)合（或其他二價陽離子）也可能是重要的影響因素。qw"加熱抗原修復(fù)方法基本包括這幾種：高壓法0微波法qdaba水煮法6t有報道，英聯(lián)邦8個國家免疫組織化學(xué)外部實驗質(zhì)量評估方案(united kingdom national ext

17、ernal quality assessment scheme for immunohistochemistry)由105家實驗室共同參與，歷時兩年時間（1996.8-1998.8），對er、 pr進(jìn)行8次循環(huán)反饋實驗，針對不同實驗室間不同實驗方法進(jìn)行比較實驗論證，最終實驗室間得出一致性公認(rèn)的實驗結(jié)論：er 、pr染色偏弱的原因，是由于微波加熱時間不足與實驗中操作控制不當(dāng)所致，故強力推薦使用高壓抗原修復(fù)方法25。6邁新實驗室與福建省三家省級醫(yī)院曾于1996年聯(lián)合進(jìn)行抗原修復(fù)不同方法對照實驗，選擇44種常用抗體，進(jìn)行不同加熱抗原修復(fù)方法對照實驗，有高壓法、微波法、水煮法三種方法，染色強度的實驗對

18、照結(jié)果是：高壓法>水煮法>微波法。同時對9例er、pr進(jìn)行微波和高壓抗原修復(fù)實驗方法對照實驗，結(jié)果顯示：高壓法的實驗重現(xiàn)性與染色強度均優(yōu)于微波法，見下表。io三個實驗室微波和高壓加熱er、pr免疫組化結(jié)果比較c4y實驗室1 實驗室2 實驗室3/微波 高壓 微波 高壓 微波 高壓per(9張乳腺癌切片) 5+,4- 5+,4- 3+,6- 5+,4- 5+,4- 5+,4-*6pr(9張乳腺癌切片) 4+,5- 5+,4- 5+,4- 5+,4- 5+,4- 5+,4-ejv合計 9+,9- 10+,8- 8+,10- 10+,8- 10+,8- 10+,8-c(q©中華病

19、理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地f2. 抗原修復(fù)液的選擇&*加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種，如檸檬酸鹽緩沖液（ph6.0）, tris (ph7-8) , edta(ph8.0)等, 目前首選檸檬酸鹽緩沖液（ph6.0），優(yōu)點是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體26，tris和 edta兩種修復(fù)液對部分抗原修復(fù)效果較強，但其染色背景同時加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。值得注意的是沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸緩沖液（ph6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適用于edta和tris緩沖修復(fù)液，一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多

20、選擇edta和tris緩沖修復(fù)液。,7%33. 加熱抗原修復(fù)對組織中內(nèi)源性生物素的影響k/.+加熱抗原修復(fù)在增強抗原決定簇表達(dá)的同時，也增強了組織中內(nèi)源性生物素的反應(yīng)。采用卵白素-生物素（avidin-biotin）方法的檢測系統(tǒng)，組織中內(nèi)源性生物素容易出現(xiàn)令人棘手的人為假象27,28,29，原因是卵白素二抗中的丙酮羧化酶中含有四個分子的生物素極易與組織中胞漿內(nèi)的線粒體結(jié)合，富含的線粒體代謝旺盛的細(xì)胞中更顯著，如肝臟、腎臟組織。嗜酸性細(xì)胞瘤（含豐富的線粒體）中更加嚴(yán)重。在許多的腫瘤組織中如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌等癌組織中內(nèi)源性生物素的人為假象也相當(dāng)普遍。但一般這種人為假象，在dab顯

21、色中粒細(xì)胞胞漿中常呈“泥沙”樣形式存在，這些細(xì)胞與細(xì)胞間缺少同質(zhì)性，一般它優(yōu)先定位在細(xì)胞的一端，且呈一定的極性分布。在與一抗加熱抗原處理條件完全相同的陰性對照片中可以觀察到較強的內(nèi)源性生物素的反應(yīng)，在沒有經(jīng)過熱抗原處理的切片中沒有出現(xiàn)類似的情況。在以往的免疫組化染色中內(nèi)源性生物素的影響因素知之甚少所以常被忽略了,而且部分文獻(xiàn)報道也有偏差30,31。在各種抗原修復(fù)緩沖液對照實驗中顯示，tris 和尿素對內(nèi)源性生物素的反應(yīng)影響最為明顯，檸檬酸最低。一般在實驗中凡進(jìn)行加熱抗原修復(fù)處理的組織都需要進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉處理，尤其值得提醒的是在概念上一定十分要清楚，陰性對照片必須與一抗的抗原修復(fù)處理條件完

22、全相同，才能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性生物素出現(xiàn)的部位。內(nèi)源性生物素封閉可以通過幾種方法處理，一般在抗原修復(fù)以后，采用0.05%未結(jié)合的avidin+pbs,在常溫下孵育20-30分鐘即可32，avidin可以與組織中內(nèi)源性生物素結(jié)合，以消除影響。22u;©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地zo3-（三）、免疫組化染色（staining）實驗操作中應(yīng)用問題hc"s1內(nèi)源性過氧化物酶的滅活601t_n在免疫組化染色中若采用過氧化物酶的檢測系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶封閉處理。如果不進(jìn)行處理，組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞可以干擾染色結(jié)果的判斷。一般采用比較緩和的方法

23、：0.3%h2o2進(jìn)行封閉處理，對染色結(jié)果及抗原保存都沒有影響。嗜酸性細(xì)胞不容易滅活，但在鏡下實際觀察中較容易被區(qū)分開。3%h2o2對抗原可能輕微的損害，但封閉效果比較顯著。u2血清封閉u,xki實驗室使用的封閉血清，一般用在加載一抗之前，血清種屬的選擇一般與二抗的種屬相同，可以減少非特異性顯色。一抗中若含有正常血清，也可以免去此步驟。3沖洗步驟z|dl實驗室中常用的沖洗緩沖液為pbs 和tbs，tween20加入到?jīng)_洗緩沖液中可以增強沖洗效果。在實際操作中應(yīng)嚴(yán)格遵守實驗沖洗步驟，防止因沖洗不充分引起的背景著色。n=$j4一抗孵育c即用型抗體（predilute ready-to-use）廠家

24、已進(jìn)行過多種實驗條件的實驗檢測，可按照廠家提供的實驗操條件進(jìn)行實驗。x=邁新實驗室針對即用型抗體穩(wěn)定性與長期保存有效性的問題做了一項實驗研究，進(jìn)行了長達(dá)一年時間對照追蹤實驗觀察，隨機選擇5種常用即用型抗體，p53、er、ck(ae1/ae3)、ema和cd45ro進(jìn)行效期實驗，將5種即用型抗體放在37恒溫箱內(nèi)，按時間進(jìn)展進(jìn)行效期實驗，每次5種抗體分別在相同時間里進(jìn)行相同條件的免疫組化染色實驗并觀察其實驗結(jié)果，360天的實驗結(jié)果見右圖，可以看出，即用型抗體在37條件下穩(wěn)定性可以保持180天之久，4冷藏條件下存放24個月是穩(wěn)定可靠的，所以合格的即用型抗體是經(jīng)得起時間考驗的，可以作為病理科常規(guī)免疫組

25、化首選試劑，使用簡單方便，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。同時實驗也證明抗體在冷藏運輸途中，一般不會引起抗體效價的降低情況。引起抗體效價降低的主要原因是反復(fù)的凍融與反復(fù)從冰箱中取出，容易導(dǎo)致抗體活性的損失。m:u濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度，進(jìn)行成倍數(shù)稀釋預(yù)實驗。舉例，如果某一抗體廠商建議稀釋度為1:50，實驗要進(jìn)行1:25，1:50，1:100, 1:200, 1:400梯度滴度實驗。選定最佳的稀釋滴度后再進(jìn)行批量實驗。關(guān)鍵注意點是要保證在已知陽性的切片中抗體滴定到完全沒有陽性反應(yīng)為止。一般染色背景深大多是抗體濃度過高所致?？贵w孵育溫度一般以常溫25為基準(zhǔn)或4冰箱過夜。wyw5檢測系統(tǒng)_yy通用的

26、檢測系統(tǒng)為生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測方法有sp、lsab、abc等，都是目前實驗研究與臨床實驗室廣泛采用的檢測方法，其方法簡便易行，試劑穩(wěn)定。sp三步法敏感度大于envision,、elivision，大約1-2倍。sp三步法高效、經(jīng)濟，為國內(nèi)免疫組化首選的檢測系統(tǒng)。j6顯色系統(tǒng)vci?z通常采用的是辣根過氧化物酶系統(tǒng)，因此選擇dab（棕色）和aec（紅色）酶底物，若采用堿性磷酸酶系統(tǒng)則選擇bcip/nbt（藍(lán)紫色）,常規(guī)免疫組化顯色首選的仍然是dab，定位清晰，易于保存。 7復(fù)染03")盡管襯染步驟十分簡單，但襯染的好壞對染色最終結(jié)果的質(zhì)量影響很大。蘇木素有不同類型，首

27、選的是harris蘇木素襯染，harris蘇木素在水中應(yīng)徹底洗滌，才可以得到亮麗的蘭色襯染效果，且與dab染色對照效果最好，在絕大多數(shù)實驗室中使用簡單方便。mq*d,s©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地cou9j（四）、免疫組化對照實驗的設(shè)立'#>1vimentin陽性對照/50fj:vimentin在免疫組化中作為陽性對照是由battifora33提出，他提出在每次實驗中增加vimentin染色作為對照，目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性，按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來進(jìn)行分析。vimentin幾乎在任何組織中都有表達(dá)，

28、尤其優(yōu)選于活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管vimentin可陽性表達(dá)，如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r，表明是過度固定導(dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實驗中應(yīng)常規(guī)加入vimentin染色，用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達(dá)敏感性情況。邁新實驗室隨機選擇福建省四家省級醫(yī)院病理科的81個各種組織蠟塊，進(jìn)行vimentin標(biāo)記批量實驗，結(jié)果觀察顯示vimentin 在組織中的表達(dá)率為96.7%(85/88 )。 2實驗陽性對照設(shè)立wj,;|1陽性對照如何設(shè)立才是最佳？病理技術(shù)人員可能在日常一次又一次的免疫組化實驗中，總在疑問選

29、擇何種對照才是合理的標(biāo)準(zhǔn)化實驗對照，而且這一點也是目前一般實驗室中最容易忽視的問題。如果一個相同的組織蠟塊同時要做多種指標(biāo)染色如ck、ema、lca、s-100和hmb-45時，僅需做一張陰性對照即可，無需同時做五張切片作對照34。但要保證陰性對照的實驗處理條件要與一抗處理條件相同，一般常規(guī)免疫組化陽性對照的設(shè)立見附表。ij目前國外一些實驗室已采用多腫瘤組織芯片來測定抗體的特異性35，組織芯片中包含有15-80種不同類型腫瘤組織（包括各種癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，肉瘤，黑色素瘤，淋巴瘤等等。）目的是觀察抗體在各種腫瘤或組織中是否有交叉反應(yīng)，已取得滿意的效果，國內(nèi)北京友誼醫(yī)院病理可采用多組織芯片對照技

30、術(shù)，48種不同正?；蚰[瘤組織對照，取得極好的效果，有條件的實驗室也應(yīng)盡快采用。c0©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地gpy對照設(shè)立o對照設(shè)立k靶組織 實驗反應(yīng) 實驗試劑$agbvimentin對照a-wo_vimentin在間質(zhì)組織中表達(dá) 反應(yīng)組織固定情況 福爾馬林過度固定將導(dǎo)致vimentin免疫活性丟失'陽性組織對照mbsdq組織中含待測抗原 一抗與靶抗原特異性的結(jié)合的有效性 測試一抗的免疫活性u|dk陰性組織對照q組織中不含待測抗原 檢測與一抗有無交叉反應(yīng) 一抗非特異性試劑對照"?（除一抗外）l:n5與一抗待測組織相同 綜合分析病

31、人標(biāo)本中觀察有無非特異性反應(yīng)， 了解待測組織中非特異性試劑的反應(yīng)$5r自身組織對照ex相同組織蠟塊連續(xù)切片 固定、處理程序不同于對照片 一抗 =m"©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地6b,s/（五）真陽性與假陽性的判定z實驗染色結(jié)果的觀察判斷中，真陽性與假陽性的判定需要豐富的經(jīng)驗，真陽性染色結(jié)果應(yīng)表達(dá)在預(yù)期對應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)的抗原中，定位清晰準(zhǔn)確，假陽性一般出現(xiàn)在非預(yù)期對應(yīng)的組織抗原中。采用過氧化物酶檢測系統(tǒng)，dab顯色所得出的“棕色”染色結(jié)果并非都是真陽性，假陽性一般較容易判定，因為假陽性在組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)中缺少細(xì)胞與細(xì)胞間的同質(zhì)性，散在性分布。個別

32、抗體偶爾出現(xiàn)定位異常，如cd20 (l26) 偶見核表達(dá)36。而且強調(diào)指出，陰性對照切片的實驗抗原修復(fù)條件必須與一抗切片的實驗條件完全一致，避免內(nèi)源性生物素造成的人為假陽性以干擾染色結(jié)果的判斷。©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地j$pk（六）免疫組化染色后(post-staining)的分析注意要點"免疫組化染色后染色結(jié)果的分析與解釋，依靠的是醫(yī)生大腦的分析，再好的技術(shù)目前還不足以能夠替代人腦的綜合分析。病理專家和病理技術(shù)人員能夠很好地識別真假陽性是很重要的，若要發(fā)揮免疫組化染色在病理診斷中的最大優(yōu)勢，病理醫(yī)生必須對該使用的標(biāo)記物的免疫反應(yīng)類型

33、與染色結(jié)果的判斷與解釋應(yīng)十分的熟悉，僅僅知道抗體的名字是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，否則很容易將抗體的解釋誤入歧途。比如部分淋巴瘤中可以出現(xiàn)上皮膜抗原（ema）的表達(dá),這并不罕見。再者nse也不是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特異性的標(biāo)記物，如果在免疫組化診斷中把nse看作是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，那將是盲目有害的。3hr4fw免疫組化在鑒別診斷中的原則強調(diào)的是聯(lián)合應(yīng)用，組合配套（panel）表達(dá)是至關(guān)重要的。當(dāng)一例病例需要進(jìn)行鑒別診斷時，病理醫(yī)生首先要清楚地把可能性的診斷一一列出來，這是非常重要的，只有在認(rèn)真觀察研究了h&e切片及與臨床病史資料以后，再選擇適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫組化染色，才能確保鑒別診斷的范圍縮小

34、到最小。所以在臨床病理實際工作中只有首先成為了一個好的形態(tài)學(xué)家才可能成為一個好的免疫組化專家。如果在鑒別診斷的各種可能性診斷中，沒有涵蓋正確的診斷，那么不管你進(jìn)行了多少次免疫組化染色，都不可能遞交出一份正確的鑒別診斷報告，這一點尤其要引起病理醫(yī)生的高度重視。xyib免疫組化的負(fù)疚感，每次病理醫(yī)生在選擇鑒別診斷試劑時都會出現(xiàn)這樣的困惑，比如一例淋巴瘤疑難片，是需要用二種還是三種，甚至是十種免疫組化試劑來進(jìn)行鑒別？或更多種選擇，惟恐增加病人不必要的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，這種負(fù)疚感很普遍。但我們往往事后看到的是部分病理誤診病例的背后，常常是缺乏全面準(zhǔn)確的免疫組化標(biāo)記資料，在病理臨床工作中病理醫(yī)生往往忙于應(yīng)付申請

35、單，病例資料分析不完全或不充分，容易導(dǎo)致診斷的偏差與錯誤，這種診斷錯誤的代價往往要遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于免疫組化的代價。#ku©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地o（七）免疫組織化學(xué)的自動化shf:g自動染色儀的不斷發(fā)展也為免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化提供了一個簡便而又可靠的保證?，F(xiàn)在最為流行的免疫組化自動染色儀是開放式自動染色儀，它是一種各種試劑高度通用的儀器，可使用絕大多數(shù)免疫組化染色的抗體、檢測系統(tǒng)和其他試劑。另外更主要的是它還具有以下主要優(yōu)點：首先，它使用電腦自動化控制代替實驗室技術(shù)人員手工操作，大大地減少了由于人工操作中出現(xiàn)誤差的機會。而且，自動染色儀能精確定量泵出嚴(yán)格地

36、按控制每次滴加試劑的量，空氣壓縮機能均勻地吹去切片上多余的液體，電子計時器將染色時間精確到秒，這一切避免了免疫組化染色過程中手工操作的偶然誤差。同時，自動染色儀還可以提供所有染色步驟的詳細(xì)細(xì)節(jié)。這些的特點都確保了染色結(jié)果的一致性與重現(xiàn)性。不同實驗室間通過選擇相同的染色過程及試劑，就可以達(dá)到相同的染色結(jié)果?，F(xiàn)在，幾千臺免疫組化自動染色儀在世界各地的實驗室里扮演著十分重要的角色，已成為了免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化中必不可少的工具。在國內(nèi)，免疫組化已經(jīng)經(jīng)歷了十幾年的手工操作階段，手工操作技術(shù)也已經(jīng)非常成熟，但隨著國際免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的要求，免疫組化自動染色儀也逐步進(jìn)入我們的病理科。就國內(nèi)醫(yī)院使用免疫組化自動染色儀

37、的反饋來看，免疫組化自動染色儀使實驗室技術(shù)人員從繁瑣的手工操作中解放出來，大大提高免疫組化工作的效率，同時也推動免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化又上了一個新的臺階。8©中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地b3|（八）免疫組織化學(xué)實驗報告免疫組化實驗報告已經(jīng)融合在病理常規(guī)報告中，報告除了供本醫(yī)院病理科與手術(shù)送檢科室間進(jìn)行程序化的規(guī)范使用外，對院外病理科實驗室間的交流也日益廣泛，故通用的標(biāo)準(zhǔn)化免疫組化報告是必不可少的，可參見診斷免疫組織化學(xué)一書中的格式37。國外實驗室的免疫組化實驗報告還包括如下內(nèi)容，一是病人的一般資料介紹；二是強調(diào)要注明標(biāo)本固定液的類型是否是由中性緩沖福爾馬林固

38、定；三是詳細(xì)的實驗操作方法與程序；四是注名選擇一抗的品名、克隆號、細(xì)胞定位及表達(dá)意義（如廣譜角蛋白cytokeratin-pan， 克隆號ae1/ae3，胞漿陽性，標(biāo)記上皮組織）；五是實驗對照設(shè)立（外部陽性對照、陰性對照、自身組織對照、vimentin指導(dǎo)對照）38,39,40。 三、免疫組織化學(xué)技術(shù)的不斷完善 免疫組織化學(xué)技術(shù)經(jīng)過了二三十年的科研與臨床的應(yīng)用，已被全球廣泛認(rèn)可。該項技術(shù)仍然是一項十分復(fù)雜的實驗技術(shù)方法，隨著臨床實際應(yīng)用的意義越來越重大，作為一項十分精確可靠的、重現(xiàn)性強的體外診斷技術(shù)方法，還需要繼續(xù)三方面的工作要做。rdn1 繼續(xù)醫(yī)學(xué)再教育)>5n2 技術(shù)的日益完善與必要

39、的實驗室間的交流和信息的共享e.3 實驗室資格認(rèn)證$<?所有實驗室應(yīng)繼續(xù)加強對免疫組化理論課程與文獻(xiàn)資料的學(xué)習(xí)，同時要在工作實踐中不斷總結(jié)實驗經(jīng)驗，完善免疫組化染色技術(shù)，讓它發(fā)展成為一種精確可靠的實驗方法6,9,41。同時規(guī)范免疫組織化學(xué)試劑廠商的產(chǎn)品質(zhì)量認(rèn)證。醫(yī)學(xué)會對各個實驗室間的實驗條件與從業(yè)人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)控認(rèn)證，以保證實驗技術(shù)的可行性與可靠性。p!目前，經(jīng)過權(quán)威資料認(rèn)證的免疫組化實驗方法已最大范圍解答了免疫組化最基本的問題，盡管在你的實驗室也可能認(rèn)為不是都完全適用。但它仍然可以作為目前免疫組化技術(shù)中一種相對的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過它可以對各種實驗室的實驗方法進(jìn)行比較衡量是有實際意義的，

40、而且免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化概念的推廣也已經(jīng)是事在必行，得到病理業(yè)界的公認(rèn)。綜上所述簡言之，免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化概念的主題思想簡要如下：88gdfk1 有豐富經(jīng)驗的病理科主任wo/-i2 經(jīng)資格認(rèn)證的技術(shù)人員3 合格的即用型免疫組化試劑4 可靠穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作方法fizk5 采用中性緩沖福爾馬林固定液組織固定_g#6 高壓加熱抗原修復(fù)方法 ;87 ph6.0檸檬酸抗原修復(fù)液t8 實驗對照的正確設(shè)立y i;0u9 真、假陽性的正確判斷a10 免疫組化染色自動化&b$11 鑒別診斷中抗體的聯(lián)合應(yīng)用y(z21c12 染色結(jié)果鏡下合理的判斷與解釋"=13 標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組化實驗報告;zb&

41、#169;中華病理技術(shù)論壇最權(quán)威的病理論壇！ - 中華病理學(xué)者交流的園地|參考文獻(xiàn)ln_8qz1. robinowitz,m. revised comments on the final ruling for ihcseditorial, appl immunohistochem. 1998; 6:116-117xrfl2. taylor cr. the total test approach to standardization of immunohistochemistry. arch pathol lab med. 2000;124:945-51.ls4#3. barnes dm, mi

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