細胞生物學實驗教案

1、植物組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康?、掌握植物細胞無菌培養(yǎng)技術(shù)。2、了解不同激素對細胞的不同誘導(dǎo)作用。二、實驗原理植物組織培養(yǎng)是20世紀60年代以來植物細胞生物學中開展起來的一項生物技術(shù)。它是借用無菌操 作方法，培養(yǎng)植物的離體器官，組織或細胞，使其在人工合成的培養(yǎng)基上，通過細胞的分裂、增殖、分 化、發(fā)育，最終長成完整的再生植株。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，不僅具有重大的理論意義，而且在生產(chǎn)實踐中也已顯示了廣闊的應(yīng) 用前景。組織分化與形態(tài)建成問題，快速繁殖與去除病毒，花藥培養(yǎng)與單倍體育種，幼胚培養(yǎng)與試 管受精，抗體突變體的篩選于體細胞無體系變異，懸浮細胞培養(yǎng)與次生物質(zhì)生產(chǎn)以及超低溫種質(zhì)保 存等方面的深入研究與

2、實際應(yīng)用，都必須借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)的根本程序和方法，深刻理解植物 細胞的全能性。三、實驗用品1、材料半夏無菌苗。2、儀器臥式滅菌鍋、超凈工作臺、烘箱、培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室。3、用具鑷子、刀、牛皮紙、marker筆、棉線。4、器皿試劑瓶50、100、1000ml、三角瓶100ml、刻度吸管0.5、1、5、10ml、培養(yǎng)皿直徑911cm。1、藥品與試劑1.藥品見下表2.70 %酒精四、實驗方法1、培養(yǎng)基的配制 配制培養(yǎng)基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)四類。各類成分濃度、用量詳見下表。表1 MS培養(yǎng)基母液配制單位：mg類別成分規(guī)定量稱取量母液體積ml擴大倍數(shù)配1升培養(yǎng)基的吸取量

3、ml大量KNO3190019000100010100NH4NO3165016500元素MgSO4 7Hq3703700KH 2PO41701700CaCl2 2H2O4404400微量 元 素MgSO4 4H2O22.302230100010010ZnSO4 7H2O8.6860H3BO36.2620KI0.8383Na2MoO 4 2H2O0.2525CUSO4 5H2O0.0252.5CoCl2 6H2O0.0252.5鐵 鹽Na2-EDTA37.253725100010010FeSO4 7H2O27.852785有 機 物 質(zhì)甘氨酸2.010050010010鹽酸硫胺素0.420鹽酸吡哆

4、素0.525煙酸0.525肌醇10050001.大量元素母液10倍液分別稱取10倍用量的各種大量無機鹽，依次溶解于大約 800ml熱的6080 C 蒸餾水中。一種成分完全溶解后再參加下一種，最后加水定容至1000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?.微量元素母液100倍液分別稱取100倍用量的微量無機鹽，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至 1000ml。3.鐵鹽母液100倍液稱取100倍用量的Na2-EDTA乙二胺四乙酸鈉和FeSO4 7出0溶于800ml重蒸水中，最后定容到 1000ml。4.有機物質(zhì)母液100倍液分別稱取50倍用量的各種有機物質(zhì)，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至

5、 1000ml，裝入棕色試劑瓶中，貯存冰箱備用。除了上述四種母液外，培養(yǎng)基中經(jīng)常附加的各種生長素和細胞分裂素也要配成母液貯存，臨用時按 濃度定量吸取參加。5.生長素如2, 4 D、IAA、NAA等。準確稱取20mg，先用2ml 95 %乙醇溶解，然后加水，定容至 20ml, 濃度為1mg/ml，再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?細胞分裂素如沖動素Kt、6-卞基嘌呤6-BA。準確稱取20mg,先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加 水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?、1L培養(yǎng)基的配制與分裝1.取 1000ml燒杯一只，加大量元素 10倍母液100ml，微量元素

6、100倍母液10ml，鐵鹽100倍母液 10ml，有機物質(zhì)100倍母液10ml。然后加水至800ml，加蔗糖30g, NAA終濃度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L < 待蔗糖充分溶解后用 1mol/L的NaOH或HCI調(diào)酸堿度為。2.取一個250mL的燒杯，加200mL蒸餾水。煮沸后加8g瓊脂條，待煮到一定境界后，液體為白色，糊了就會有點偏黃，但液體中最好不要還可見條狀的瓊脂。煮瓊脂時順便把剛剛的 800mL液體也加熱至50-60度，待瓊脂煮好后再混合就能防止瓊脂凝固。由于加熱揮發(fā)，瓊脂溶液少于200ml,混合后要定容至1L。分裝到培養(yǎng)用三角瓶中， 每只50ml三角瓶約裝25m

7、l培養(yǎng)基。分裝時要防止把培養(yǎng)基倒在瓶口上， 如果這樣做了就用濾紙擦一擦，否那么培養(yǎng)時容易引起雜菌污染。3.把牛皮紙裁成適當大小的長方形，背靠背折起來，使成正方形，緊密裹在瓶口上，隨后便可進行 滅菌。培養(yǎng)基的種類和附加成分是根據(jù)培養(yǎng)物的種類、外植體的來源以及具體的實驗?zāi)康暮鸵髞泶_定的。培養(yǎng)基中附加的蔗糖濃度均為0.8% m/v。3、培養(yǎng)基的滅菌把裝好培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中，蓋好鍋蓋，我們此次用的是臥式滅菌鍋，用法比擬特別。首先最重要的是要確保水加夠，然后放氣閥為確保平安是一直開著的，先將旋鈕打在關(guān)閉上，翻開電源,當?shù)谝淮渭訜岬娘@示燈滅了之后，轉(zhuǎn)換旋鈕至滅菌，當?shù)诙渭訜釤魷绲臅r候，開始

8、計時20min，然后關(guān)閉電源，打到慢排至壓力降到0.05MPa再打到快排，降到0.02MPa后再換成全排，降至零后再換成關(guān)閉，翻開蓋子透氣，讓紙慢慢變干。放氣過程有聲音，所以也可以通過聲音來判斷是否該轉(zhuǎn)換。3、超凈臺的操作兩小時前先用70%酒精擦拭超凈臺，擦好后關(guān)上擋風玻璃，按D翻開紫外，接種前15分鐘，關(guān)閉紫外，翻開大風，稍微將擋風玻璃翻開一點。先在外面把手洗干凈， 然后在超凈臺內(nèi)先用 70%酒精浸泡過的棉球擦拭工作臺的臺面。放入培養(yǎng)瓶和接種工具，接種用的鑷子、解剖刀、接種針及培養(yǎng)皿等可事前放入，點燃酒精燈，用酒精棉球 擦拭手。把鑷子、解剖刀、接種針燈插入盛70%酒精的廣口瓶中。取一瓶半夏的

9、無菌苗，先將整瓶苗分裝到各個培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水紙上以防交叉感染，吸干水后，把葉 子切成3X 5mm大的小片，翻開三角瓶，把葉片投入瓶內(nèi)，用接種針撥勻，重新蓋上牛皮紙，扎上棉線。用記號筆在瓶壁上寫明培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基代號，標明接種日期。全部接種工作都是在嚴格無菌條件下進行的，所以要特別認真、仔細、以防雜菌污染。五、培養(yǎng)和觀察接種完畢后取出培養(yǎng)瓶，置 2628 C恒溫培養(yǎng)箱室內(nèi)，先暗處理三天再移置在光照條件下培養(yǎng)，定期進行觀察。一般三天染細菌長菌處有渾濁的液體，七天染真菌長菌處有霉和普通的霉差不多如有污染那么棄之，培養(yǎng) 34周后觀察實驗結(jié)果。有興趣的找小老師做胡蘿卜。五、實驗結(jié)果1、 計算接種成功率指沒

10、被污染的葉片數(shù)占總?cè)~片的百分比和誘導(dǎo)成功率指誘導(dǎo)出細胞的葉片數(shù) 占總?cè)~片的百分比。如果沒有添加植物激素結(jié)果又會怎樣？為什么？2、人工條件下培養(yǎng)的植物離體器官、組織或細胞，經(jīng)過分裂、增殖、分化、發(fā)育，最終長成完整 植株的過程說明什么問題？細胞內(nèi)DNA和RNA的顯示【目的要求】1、掌握顯示細胞內(nèi)DNA和RNA的方法。2、熟悉細胞內(nèi)DNA和RNA的分布位置?！緦嶒炘怼亢怂崾撬嵝缘模鼈儗τ趬A性染料派洛寧和甲基綠具有親和力。利用這兩種染料的混 合液處理細胞，可使其中的 DNA和RNA呈現(xiàn)出不同的顏色，這種顏色上的差異由 DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因為甲基綠分子上有兩個相對的正電荷，它與聚

11、合程度較 高的DNA分子有較強的親和力，可使 DNA分子染成藍綠色；而派洛寧分子中僅一個正電 荷，可與低聚分子RNA相結(jié)合使其染成紅色。這樣細胞中的 DNA和RNA可被區(qū)別開來5-5甲基綠派洛寧結(jié)構(gòu)式【器材與試劑】1、器材：光學顯微鏡、載玻片、蓋玻片、染色缸、染色架、注射器。2、材料：雞血。3、 試劑：0.2mol/L醋酸緩沖溶液、2%甲基綠染液、1%派洛寧染液、甲基綠派洛寧 混合染液。4、試劑的配制(1) 0.2mol/L醋酸緩沖溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸參加到98.8ml蒸餾水中， 混勻。再稱取醋酸鈉(NaAC 3出0) 2.72g溶于100ml蒸餾水中，使用時按2： 3的比

12、例 混合兩液即成。(2) 2%甲基綠染液：稱取2.0g去雜質(zhì)甲基綠溶于100ml0.2mol/L的醋酸緩沖溶液中即成。甲基綠粉中往往混有影響染色效果的甲基紫，它們必須預(yù)先除去，其方法是將甲基綠 溶于蒸餾水中，放在分液漏斗中參加足量的氯仿(三氯甲烷)用力振蕩，然后靜置，棄去 含甲基紫的氯仿，再參加氯仿重復(fù)數(shù)次，直至氯仿中無甲基紫為止，最后放入40 C溫箱中 枯燥后備用。31%派洛寧染液：稱取1g派洛寧吡羅紅溶于100ml0.2/L醋酸緩沖溶液中混勻。4甲基綠派洛寧混合染液：將 2%的甲基綠液和1%的派洛寧液以1： 1的比例混合 均勻即可。該液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置?！緝?nèi)容與方法】1、去雞血一小滴在

13、干凈的載玻片一端，用另一載玻片的一端緊貼血滴，待血液沿其邊 緣展開后，以304C0角向玻片的另一端推去，制成較薄的血涂片，室溫下晾干。2、固定：將晾干的血涂片浸入 70%乙醇中固定10分鐘，取出后在室溫下晾干。3、 染色：滴甲基綠派洛寧混合染液于血膜上，染色15mi n。4、沖洗：用蒸餾水沖洗標本片，并用吸水紙吸去玻片上多余的水分， 但不要吸得過干。5、分化：將血涂片在95%酒精中迅速地過一下，進行分色，取出晾干。6、觀察：光鏡下可見細胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，細胞核呈綠色。【作業(yè)與思考】1、簡述DNA和RNA的染色原理。2、細胞核中核仁理論上應(yīng)被染成何種顏色？為什么？雞血細胞體外融合【實驗?zāi)康摹?了解聚

14、乙二醇誘導(dǎo)體外細胞融合的根本原理。2通過PEG誘導(dǎo)雞血細胞之間的融合實驗，初步掌握細胞融合的根本方法?！緦嶒炘怼考毎诤嫌址Q體外細胞雜交，是指用人工方法使兩個或兩個以上的體細胞融合成異核 體細胞，隨后，異核體細胞同步進入有絲分裂，核膜崩潰，來自兩個親本細胞的基因組和 在一起形成只含有一個細胞核的雜種細胞。細胞融合技術(shù)是研究細胞遺傳、基因定位、細 胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。依據(jù)融合過程采用的助融劑的不同，細胞融合可分為： 1病毒誘導(dǎo)的細胞融合，如仙臺病毒；2化學因子誘導(dǎo)的細胞融合，如 PEG； 3電場誘導(dǎo)的 細胞融合；4激光誘導(dǎo)的細胞融合。PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子質(zhì)量的

15、多聚體。PEG可改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細胞融合。該方法應(yīng)用相對 分子質(zhì)量為400-6000的PEG溶液引起細胞的聚集和粘連，產(chǎn)生高頻率的細胞融合。融合的 頻率和活力與所用PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時間、細胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)?！緦嶒瀮x器、材料和試劑】1儀器、用具：注射器、離心管、離心機、水浴鍋、滴管、顯微鏡燒杯、容量瓶、 載玻片、蓋玻片、酒精燈等。2材料：雞血細胞。(3) 試劑：1) 0.85%NaCI溶液2) GKN液: 8.0gNaCI, 0.4g KCI, 1.77g Na2 HPO型H20, 0.69g NaH2PO4H2O, 2.0g

16、 葡萄糖，0.01g酚紅，溶于1L蒸餾水中。3) 50% (m/v) PEG溶液：取 50g PEG4000水浴融化后冷卻至 5060C加 50m 預(yù)熱至5060C的GKN液，混勻，至于39C備用。4) Hanks 原液(10X):80.0g NaCl, 1.2g Na2 HPO42H2O, 4.0g KCl , 0.6g KH2PO4,2.0g MgSO7H2O, 10.0g 葡糖糖，1.4g CaCl2 稱取1.4g CaCl2溶于3050mL蒸餾水中。 取1L的燒杯及容量瓶各一個，先在燒杯中放入 800mL蒸餾水，然后按上述 配方順序，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解之后，方可參加下

17、一藥品， 直到葡糖糖完全溶解后，再將已溶解的 CaCl2溶液參加，最后加水至1L。5) Hanks液：Ha nks 原液100mL蒸餾水896mL0.5%酚紅4mL配好的hanks液保存于4度冰箱?！痉椒ㄅc步驟】1制作雞血細胞儲藏液取來雞血后，按照100U肝素/5mL全血的比例制成抗凝全血，然后再在其中參加4倍體 積的0.85%NaCl溶液，制成紅細胞儲液，置于 4C冰箱內(nèi)可供一周使用。2細胞懸液的制備取雞血細胞儲藏液1mL，參加4mL0.85%NaCI溶液，混勻后，1200r/min離心5min， 棄去上清液，再參加5mL0.85%NaCl溶液按上述條件離心一次。最后，棄去上清液，參加 3m

18、L的GKN溶液制成雞血細胞懸液。3雞血細胞的收集吸取1mL雞血細胞懸液放入離心管中，參加4mL Hanks液混勻，1000r/min離心5min。 棄去上清液，用手指輕彈離心管底部，使沉淀的血細胞團塊松散。4.PEG誘導(dǎo)細胞融合(KEY )吸取1mL 39度的50%PEG溶液，沿著管壁迅速參加然后立即輕輕搖勻(此步非常容 易造成血液凝集，不要拿離水浴鍋太長時間)。39度水浴4min。5終止PEG作用緩慢參加5mL Hanks液，輕輕吹打混勻，置于39度水浴鍋中靜置5min。6制備細胞懸液用吸管輕輕吹打細胞團塊分散(KEY )，1000r/min離心5min,使細胞完全沉降。棄去上 清液，加50

19、0卩L Hanks,混勻。7鏡檢在載玻片上滴一小滴細胞懸液，蓋上蓋玻片，先在10倍鏡下找到細胞，再在40倍鏡下看，如看到有疑似融合的，先調(diào)焦做第一次確定，如假設(shè)確定通過，再用100倍鏡確定另外，視野較暗會比擬容易觀察。Feulgen 反響一、實驗?zāi)康膶W習Feulgen反響的原理與操作步驟。二、實驗原理Feulgen反響是由Feulgen和Rossenbeck于1924年創(chuàng)立，是特異性顯示 DNA的最經(jīng)典方法。 它主要包括DNA水解和顯色兩個反響步驟。DNA在60C條件下經(jīng)稀酸1mol/L HCL 水解，分 子中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，在脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與

20、Schiff試劑反響，形成紫紅色的化合物，因此，細胞內(nèi)含有DNA的部位會呈現(xiàn)紫紅色陽性反響。 福爾根反響即可進行DNA定位顯示，又可用顯微分光光度計驚醒定量分析。Feulgen反響對組織中的DNA高度專一，組織中除DNA外還有多糖、RNA和其他自由醛基， 固定液也可能產(chǎn)生一些醛基。但是，自由的醛基可能被鹽酸酸解消除，絕大多數(shù)RNA經(jīng)1M鹽酸在60C溫度下處理會降解為可溶性成分，而多糖在此反響條件下那么不會產(chǎn)生裸露的醛醛基。材料 不經(jīng)過水解或預(yù)先用熱的三氯醋酸或 DNA酶處理，得到的反響是陰性的，從而證明了 Feulgen反 應(yīng)的專一性。三、實驗用品1、材料:洋蔥根尖2、器材：解剖刀、鑷子、水浴

21、鍋、載玻片、蓋玻片、3、藥品與試劑：1mol/L 鹽酸：取82.5ml密度1.19g/ml濃鹽酸加蒸餾水至1000ml。Schiff 試劑：稱取0.5g堿性品紅參加到100ml煮沸的蒸餾水中用三角瓶，時時震蕩，繼續(xù)煮5min 勿 使之沸騰，使之充分溶解。然后冷卻至 50E時用濾紙過濾，濾液中參加10ml1mol/LHCl， 冷卻至25C時，參加0.5gNa2S2O5充分震蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處理靜止至少24h 有時需23d，使其顏色褪至淡黃色，然后參加 0.5g活性炭，用力震蕩1min，然后用粗濾紙 過濾于棕色瓶中，封嚴瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無色也無沉淀，貯于4C冰箱中備用。如有白色沉淀

22、，就不能在使用，如顏色變紅，可參加少許偏重亞硫酸鈉或偏重亞硫酸鉀，使 之再轉(zhuǎn)為無色，仍可使用。亞硫酸水：200ml自來水、10ml 10%偏重亞硫酸鈉或偏重亞硫酸鉀溶液、10ml 1mol/L HCl，使用前，三者混勻使用。四、實驗步驟1將洋蔥根尖放在1mol/L HCI中，在60C水浴鍋中保溫810min。2、蒸餾水水洗。3、Schiff試劑遮光染色30min。4、用新鮮配制的亞硫酸水溶液洗滌 3次，每次1min。5、水洗 5min。6、將根尖放在載玻片上，鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，壓片。7、鏡檢，細胞中但凡有 DNA的部位應(yīng)呈現(xiàn)紫紅色的陽性反響。&找出根尖正在分裂的細胞，并找出它的前、

23、中、后、末、間等五個時期 對照組：先將材料放在5%三氯醋酸中90C水浴15min,其他步驟同實驗組。細胞凝集反響一、實驗?zāi)康牧私饧毎さ慕Y(jié)構(gòu)與功能。二、實驗原理細胞膜是雙層脂鑲嵌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，脂和蛋白質(zhì)又能與糖分子結(jié)合為細胞外表的分枝狀 外被。目前認為：細胞間的聯(lián)系，細胞的生長和分化，免疫反響和腫瘤發(fā)生都和細胞外表 的分枝狀糖分子有關(guān)。凝集素(lectin)是一類含糖(少數(shù)例外)的并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細胞和 刺激細胞分裂的作用。凝集素使細胞凝集是由于它與細胞外表的糖分子連接，在細胞間形 成“橋的結(jié)果，參加與凝集素互補的糖可以抑制細胞的凝集。三、實驗用品2、土豆塊莖3、顯微鏡、粗天

24、平、載玻片、滴管 2支、離心管2支。4、PBS緩沖液NaCl7.2gNa2HPO41.48gKH2PO40.43gH2O1000ml5、2%的紅細胞四、實驗步驟1、2%的紅細胞的制備：取一定量的紅細胞，用生理鹽水洗 5次，每次2000r/min,離心5min，最后按壓積紅細胞體積用生理鹽水配成2%紅細胞液。2、 稱取去皮土豆塊莖2g,加lOmIPBS緩沖液，浸泡2h,浸提液中含有可溶性淀粉土豆凝 集素。3、 用滴管吸取土豆凝集素和 2%紅細胞液各一滴，置于載玻片上，充分混勻，靜置20min 后，于倒置顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。4、以PBS液加2%血細胞液作對照實驗。五、實驗報告：簡圖表示血細胞

25、凝集原理。細胞膜的滲透性一、實驗?zāi)康牧私饧毎さ臐B透性及各類物質(zhì)進入細胞的速度。二、實驗原理將紅細胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細胞對各種溶質(zhì)的透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入， 有的溶質(zhì)不能滲入，滲入的溶質(zhì)能夠提高紅細胞的滲透壓，所以水分進入細胞，引起溶血， 溶質(zhì)滲入速度不同，因此溶血時間也不同。三、實驗材料和試劑1、器材50ml小燒杯，10ml移液管，試管，試管架。2、材料：動物血液3、 試劑：0.17mol/L氯化鈉、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸鈉0.12mol/L草酸銨和0.12mol/L硫酸鈉0.32mol/L 葡萄糖、0.32mol/L 甘油、

26、0.32mol/L 乙醇和 0.32mol/L 丙酮四、實驗方法1、動物血液的稀釋：取1份血液，參加10份0.17mol/L氯化鈉溶液即可。2、低滲溶液：取試管一支，參加 5ml蒸餾水，再參加0.5ml稀釋的血液，注意觀察溶液顏 色的變化，由不透明的紅色逐漸澄清，說明紅細胞發(fā)生破裂造成100%紅細胞溶血，使光線 比擬容易透過溶液。3、紅細胞的滲透性：取試管一支，參加0.17mol/L氯化鈉溶液5ml，再參加0.5ml稀釋的血液，并輕輕搖動，注意顏色有無變化？有無溶血現(xiàn)象？為什么？取試管一支，參加0.17mol/L氯化銨溶液5ml，再參加0.5ml稀釋的血液，并輕輕搖動， 注意顏色有無變化？有無

27、溶血現(xiàn)象？假設(shè)發(fā)生溶血，記下時間 自參加稀釋血液到溶液變成紅 色透明澄清所需時間。分別在另外幾種溶液中進行同樣的實驗。步驟同上。五、實驗結(jié)果討論與分析將觀察倒的現(xiàn)象列入下表，對實驗結(jié)果進行比擬和分析。試管編號是否溶血時間結(jié)果分析1.5mlNaCI + 0.5ml 稀釋血液2. 5mlNH4CI + 0.5ml 稀釋血液3. 5mlNH4Ac + 0.5ml 稀釋血液4. 5mlNaNO3+ 0.5ml 稀釋血液5. 5ml草酸銨+ 0.5ml稀釋血液6. 5mlNa2SO4 + 0.5ml 稀釋血液7. 5ml葡萄糖+ 0.5ml稀釋血液8. 5ml甘油+ 0.5ml稀釋血液9. 5ml乙醇+

28、 0.5ml稀釋血液10. 5ml丙酮+ 0.5ml稀釋血液人外周血細胞培養(yǎng)及染色體制備I微量全血培養(yǎng)1966年以前根本上用Moorhead等1960年建立的人體外周血白細胞培養(yǎng)技術(shù)，它的優(yōu) 點是方法比擬完善。缺點是取血量較多，手續(xù)較麻煩。近三十年來國內(nèi)外絕大多數(shù)均采用 微量全血培養(yǎng)技術(shù)，不但取血量少，而且可略去一些操作過程，如離心、別離血漿等，計 數(shù)時，既方便，也節(jié)省人力與物力，便于推廣應(yīng)用。實驗?zāi)康脑隗w外培養(yǎng)外周血淋巴細胞，制備人的染色體實驗原理在活體情況下，進入外周血的小淋巴細胞不能進行增殖，存活一定時間后就死去，由新 進入外周血的小淋巴細胞補充。但在人工離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的PHA

29、 phytohemaggluti nin,植物血細胞凝集素有刺激小淋巴細胞轉(zhuǎn)化并進行分裂的能力。此時 如參加適量秋水仙素或秋水酰胺，便可使許多分裂細胞停滯于中期。采用常規(guī)制片技術(shù)， 即可得到大量含染色體的標本。實驗用品材料 人靜脈血器材超凈工作臺、恒溫箱、離心機、顯微鏡、移液管5ml 、鏈霉素瓶或25ml組 織培養(yǎng)方瓶、血漿瓶100ml、注射器1ml、2ml、燒杯100ml、量筒50ml、剪刀、 鑷子、酒精燈、精密PH試紙試劑RPMI-1640液或Eagle '液，小牛血清、肝素、PHA、雙抗青、鏈霉素、5%NaHCO3、 2%碘酒、75%酒精、2ug/ml秋水仙素或2ug/ml秋水酰

30、胺淋巴細胞培養(yǎng)基組成，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、PHA、肝素、抗菌素等。人工合成培養(yǎng)液有很多種，一般常用的有TC-199、McCoy5A、Ham F-10、Ham F-12、 RPMI-1640等，PHAphytohemagglutinin,植物血細胞凝集素是從豆子四季 豆、雪山大豆、雞子豆等經(jīng) 0.85%生理鹽水浸漬后提取的一種糖蛋白。實驗方法培養(yǎng)基的制備將無菌室紫外線燈開放12小時，洗和刷手，穿上無菌衣，拖鞋進入無菌室，開啟超凈工 作臺，關(guān)閉超凈工作臺的紫外線燈。用75%酒精擦洗手和各種試劑瓶，然后將 RPMI-1640培養(yǎng)液或其他培養(yǎng)液、血清、肝素、雙抗、PHA等移入工作臺上。取10ml

31、培養(yǎng)瓶鏈霉素瓶1個，內(nèi)裝：RPMI-1640 液4 ml小牛血清1 ml肝素(600IU/ ml)0.03mlPHA(5mg/ml)0.04ml青、鏈霉素青霉素 10 000 IU/ ml、鏈霉素10 000 ug/ml0.05 ml1 ml注射器、5#針頭、5滴，相當于最終濃度為青霉素 100 IU/ ml，鏈霉素100 ug/ml混勻后吸一滴測PH,如偏酸，可加5%NaHCO3，、如偏堿，可加1mol/L HCl，調(diào)整至PH6.87.0 米血用肥皂和水洗凈供血者之手，再用 2%碘酒、75%酒精擦指尖，待酒精完全揮發(fā)干后，用無 菌采血針或三棱針刺破指尖，用無菌吸管吸血0.30.4ml移入培養(yǎng)

32、瓶，輕輕搖動，使血與培養(yǎng)液混勻即可培養(yǎng)?；蛴?2ml注射器，7#針頭，先吸取肝素少許濕潤針筒，從肘靜脈采血 12ml，每個培養(yǎng)瓶接種全血0.3ml左右。亦可去產(chǎn)院取臍帶血作培養(yǎng)。培養(yǎng)在37± 0.5C溫養(yǎng)箱中培養(yǎng)6872小時，終止培養(yǎng)前610小時加秋水仙素2ug/ml,或 秋水酰胺2ug/ml用1ml注射器接5#針頭加34滴，使最終濃度為0.050. 2卩g/m。II人淋巴細胞染色體標本的制作實驗?zāi)康某醪秸莆杖旧w標本制作方法及其原理了解人染色體的形態(tài)與數(shù)目實驗原理被秋水仙素或秋水酰胺停滯于中期的大量分裂細胞，用低滲溶液處理一般用KCL 或其他低滲液使樣品中的紅細胞膜破裂，并使分裂細

33、胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細胞膨脹，結(jié)合離 心技術(shù)，即可去掉紅細胞碎片。再用固定液甲醇：冰醋酸 =3： 1使已膨脹的分裂細胞和 轉(zhuǎn)化的淋巴細胞膜破裂，隨著分裂細胞膜破裂，染色體被釋放出來，并且將其形態(tài)固定下 來通過低滲和固定，同時也使細胞質(zhì)和染色體上局部蛋白質(zhì)喪失。然后采用空氣枯燥法制片，即可得到滿意的染色體標本。實驗用品材料培養(yǎng)三天的人血器材恒溫水浴37±05C、相差顯微鏡，水平離心機，藥物天平稱量100g,燒杯100ml, 尖底離心管10ml，吸管，清潔載玻片制片前放置于 40%乙醇溶液中，冰箱4C至少保 存1小時，量筒50ml，廢液杯500ml，磨口試劑瓶100ml，酒精燈，橡皮頭，試 管架，定時鐘試劑低滲液：0.4%KCL potassium chloride AR固定液：甲醇methyl alcolnol AR,冰醋酸冰乙酸acetic acid glacial AR每次在使用前按3:1新鮮配制3. Giemsa原液配制Giemsa 染粉1g